多外显子跳跃在犬X连锁肌营养不良用鸡尾酒反义寡核苷酸

摘要

外显子跳跃目前是杜氏肌营养不良症（DMD）一个最有希望的治疗选择。扩大对DMD患者的适用性和优化所得截短的肌营养不良蛋白的稳定性/功能，一个多外显子用鸡尾酒的反义寡核苷酸跳过方法被开发，我们证实在狗模型全身肌营养不良蛋白救援。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的致命性遗传疾病全世界引起的肌营养不良 （DMD）基因的突变之一。外显子跳跃采用短DNA / RNA样分子，称为反义寡核苷酸（AON的）的恢复阅读框，并产生短，但功能性蛋白。然而，外显子跳跃治疗面临两大障碍:有限的适用性（最多只有13％的患者可以用单个AON药物进行治疗），和截短蛋白的不确定功能。这些问题与鸡尾酒AON的方法得到解决。而DMD患者的约70％可以由单一的外显子跳跃治疗的（所有外显子相结合），如果多个外显子用鸡尾酒反义药物跳绳可以实现人们可以潜在地治疗的90％以上的DMD患者。犬X连锁肌营养不良症（CXMD）狗模型，其表现型是更类似于人类的DMD患者中，用于测试全身efficACY和外显子6和8 CXMD狗模型的多外显子跳跃的安全窝藏在内含子6的剪接位点突变，导致肌营养不良蛋白 mRNA的缺乏外显子7。以恢复CXMD阅读框要求外显子6和8的多外显子跳跃;因此，CXMD为测试多外显子跳跃的有效性和安全性良好的中型动物模型。在目前的研究中，反义吗啉靶向外显子6和外显子8的鸡尾酒设计和它在全身性骨骼肌恢复肌养蛋白表达。鸡尾酒寡核苷酸转/注射的疗效，并在CXMD狗模型多外显子跳跃的安全性评价方法介绍。

引言

假肥大型肌营养不良症（DMD）是X连锁隐性肌肉疾病，其特征为进行性肌无力，首先由纪尧姆-本杰明·阿芒博士杜兴（de Boulogne公园^）1描述。 DMD是影响约1 3500世界各地的男孩，每年^2,3出生约20,000受灾儿童常见的遗传性疾病。运动发育延迟和步态障碍被认为在幼儿^4，其次是依赖轮椅在大约十几岁。死亡通常发生在20到30的由于呼吸或心脏衰竭^5-8岁之间。目前还没有治愈DMD。用糖皮质激素治疗肌肉变性的进展可减缓到一定程度，但与显著的副作用，包括肥胖和糖尿病^2,7,8相关联。 DMD由突变导致肌营养不良 （DMD）基因，导致功能性肌养protei的损失ñ。DMD是一个非常大的基因超过200万个碱基对，79个外显子^9,10。删除，胡说八道，和重复的突变导致了帧的突变是DMD表型的最常见原因。图9和外显子45 - -外显子3的区域55被称为"突变热点"，因为大多数病人有基因的这些部分内的缺失突变，导致非功能性肌养蛋白在DMD患者^3,9,11-16。肌营养不良蛋白 - 糖蛋白复合物（DGC），其具有在肌膜稳定主要作用于抗肌萎缩蛋白的功能。 N-和C-末端是功能的最重要的结构域，而中央杆域起着同样重要的作用^，3,9,17。与Becker型肌营养不良（BMD），其中大部分来自于帧中的DMD基因的突变内相关结果温和型的纪念活动，激发了外显子跳跃治疗DMD的应用。 BMD患者已经缩短，但泛函L，抗肌萎缩蛋白维持两端^3,6,18。外显子跳跃，在理论上，可以恢复阅读框架，导致类似于在骨密度^3,19看出缩短，但是，功能性肌养蛋白。

多种类型的反义寡核苷酸（AON的）已经在临床试验中，包括2'O甲基化磷酸酯（2'OMePS）和磷酰吗啉代寡聚物（PMOS）进行了测试。使用这些的AON跳过外显 ​​子51和53已被检查，而结果是令人鼓舞的，单外显子跳跃具有有限的适用性，因为它是^{3，19，20,21，22-26}特定突变。问题也仍然关于从单外显子跳跃^22,23产生的所得缩短肌养蛋白的稳定性。此外，一些患者需要比单一的外显子多，以便恢复阅读框³被跳过。虽然在技术上比较难，多外显子跳跃是一个方法，可以解决这些问题^3,19。多外显子跳跃先前已被证明在营养不良狗和体外人细胞系。此外，mdx52小鼠和犬X连锁肌营养不良症（CXMD）犬模型已被用于体内研究^{22，24-27。}犬X连锁肌营养不良日本（CXMD _J），比格犬在这里使用的，如CXMD _的J阅读框可通过外显 ​​子6和8，或附加的外显子（ 例如 ，外显子3 - 9）的多外显子跳跃恢复（ 图1）。基于小猎犬-CXMD共用相同突变图案金毛肌营养不良症（GRMD）模式，但小猎犬由于他们的身体尺寸更小，更便宜的维护，从而提供了DMD ^28,29的有用模型。 CXMD狗更紧密地模仿人类的DMD型小于动物模型，如啮齿动物，而且更可靠毒理学评估^3,22,30,31 （ 图2）。 CXMD狗显示渐进性肌肉衰减，步态障碍，以及心脏和呼吸问题类似于DMD看到。具有单外显子跳跃相比，多外显子跳跃适用于患者更大的比重。其中最常见的三种突变类型（缺失，胡说八道，和重复），80 - 98％的患者可以通过多外显子跳跃^14,32,33从具体跳绳外显子45治疗，而所有DMD患者中45％可受益- 55 ^{3,19,22,34。}

随着修改吗啉的发展，AON鸡尾酒便利外显子跳跃效率有所提高。精氨酸丰富的细胞穿透肽结合的项目管理办公室（PPMOs）和体内吗啉（vPMOs）是AON化学已显著改善细胞穿透能力和稳定性^3,35-38。担忧仍然对长期AON毒性;然而，显著进步已经被造好。向吗啉制成化学修饰大大减少的脱靶效应和临床前研究已经报道没有显著毒性作用^{3,22,39,40。}对于多外显子跳跃的剩余挑战是毒性单独测试每个单AON现行规定，作为单药治疗，而不是一起作为鸡尾酒^{3,19,22,41,42。}在涉及单和多外显子跳跃针对性的心脏DMD的研究，出现了营养不良的心脏组织几乎没有改善。在心脏吗啉的功效被认为是由于较差的细胞渗透能力低。肽结合的PPMOs具有改善的AON穿透心肌细胞的能力，增加功能性肌养蛋白在心脏^3,19,38获救的量。

在这里，我们的AON鸡尾酒方法详细讨论，其中包括使用ESEfinder软件⁴³ AON序列的设计。 Protoc对于狗实验多外显子跳跃醇类也有所说明。 _CXMDĴ只比格犬用于外显子6和8跳过实验。多外显子中的CXMD狗模型跳过示出有前景的结果，但挑战仍然存在它们在临床上适用之前需要被克服。

研究方案

下面列出的所有协议都是按照由神经内科在日本的国家中心和精神病学（NCNP）规定的动物护理准则。所有的实验是由NCNP的机构动物护理和使用委员会批准。

1.反义寡聚物设计

1. 使用救援ESE和ESEfinder程序来检测ESE位^{44，45-47。}
2. 这是反义要被靶向的外显子设计25个碱基对（bp）的序列。目标外显子6和在狗模型8（ 图1）。
   1. 使用25 -用于PMOS 30 bp的序列（ 表1）或25个基点2'OMePS。要设计25个基点的序列，选择在目标区域内的序列。考虑二级结构，避免异的，外显子剪接增强图案，以及GC含量创造稳定的序列^43。的AON应定位的ESE位点中的至少一个所确定的上述SOFtware。
   2. 用GC含量即少于65％，少于4个连续的'G的，并且不包含自互补序列中选择的AON。使用NCBI BLAST软件来预测脱靶退火网站^22,48,49。
3. 选择一个合适的AON骨干化学。 在体外实验中使用2'O甲基寡核苷酸（2'OMePS）或吗啉代。为进行体内实验，使用2'OMePS，吗啉或^{vPMOs。3,19,48,50}

2. 在体外实验（外显子6和8中的CXMD模型跳过）

1. 狗成肌细胞的转染2'OMePS
   1. 培养CXMD成肌细胞在6孔板3毫升生长培养基。种子1 - 5×10 ^3个细胞/ cm ²用0.5ml /对成肌细胞培养基厘米^2。对于生长培养基，用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和10％胎牛血清（FBS）和1％的青霉素/链霉素（P / ^S）40。
   2. 孵育在37℃，直至60％ - 80％汇合。这大约需要12至24小时。
   3. 稀的阳离子脂质体转染试剂总共100μl的降低血清培养基（2:1的比例转染试剂:的AON， 比如 ，10微升脂转染试剂与5微克的AON）。允许混合物在室温放置30 - 45分钟。
   4. 稀的AON（2'OMePS或吗啉代）至100μl血清培养基减少的最终体积。
   5. 结合稀释转染试剂与稀释的AON，并在室温孵育10 - 15分钟。
   6. 而转染试剂/ AON混合物坐在RT，通过抽吸从细胞中移除旧的媒体和洗涤细胞与媒体。
   7. 0.8毫升介质添加到转染试剂/ AON混合物，然后将整个溶液添加到新鲜洗涤的细胞。在37℃下孵育3小时。
   8. 孵化后，更换分异媒体离子介质（DM）;分化可能需要长达10天。检查，看看是否已经发生分化开始在天3.分化培养基周围是DMEM，用2％马血清，200U / ml青霉素，200毫克/毫升链霉素和10微克/毫升的胰岛素。
2. 狗成肌细胞的转染吗啉
   1. 如步骤2.1描述文化CXMD成肌细胞在生长培养基中。
   2. 切换到分化培养基（DM），并添加0.1毫库存啉向每个孔，使最终浓度为1μM。在65℃下热鸡尾酒吗啉用于转染或注射前10分钟，以避免AON聚集。添加的肽递送试剂^39,51和调整至3中的最终浓度- 6微米。
   3. 经过16 - 培养48小时，收集RNA提取细胞。 1毫升酸性硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿添加到细胞中，以分离从板的细胞。执行RNA为Extrac此步骤后化。
      1. 备选地，添加胰蛋白酶，使得它覆盖所有的细胞，并在37℃下孵育2分钟。
         注意:如果打算进行免疫组化，使用滑腔眼镜培养。分化后，细胞可以用多聚甲醛（PFA）（10分钟4％）是固定的。
3. RNA提取和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
   1. 一旦细胞分化为肌管，除去培养基并加入1毫升的酸性硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿;在室温下孵育10分钟。
   2. 转移到1.5毫升管。用200μl氯仿结合，并在室温下孵育2分钟，直到三个独立的层可以看出。三层从上到下是:一种RNA层，脱氧核糖核酸层和蛋白层。
   3. 离心机以12,000×g下在4℃下15分钟。 500＆＃删除在管顶层上清和地点181，L异丙醇（如果停留于此，保存在-80℃的上清液）。离心上清液以12,000×g的10分钟，4℃;离心后，保持所得到的RNA沉淀并弃去上清液。
   4. 在4℃下洗涤，用乙醇和离心沉淀在8000 xg离心5分钟。通过倒转该管15分钟蒸发残余的乙醇，然后加入15 - 30微升不含RNA酶的水。量化使用美国/可见光谱在260纳米的总RNA浓度。
   5. 结合所需的试剂用于RT-PCR反应:1.5微升10μM的正向引物，1.5微升10μM反向引物，1微升的dNTP，5微升一步法PCR试剂盒缓冲液，0.7微升RNA酶抑制剂，1微升酶混合物从单步骤PCR试剂盒，和RNA的200纳克。一旦这些被混合，加水至25微升最终体积。
   6. 放置混合物在一个热循环仪。在50℃下，用15分钟运行30分钟周期0;循环在95℃，然后35个循环的94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟。最后，在72℃下运行10分钟的循环。商店的PCR产物在冰箱中在4℃或-20℃
4. 互补DNA（cDNA）测序
   1. 确定外显子6 - 用琼脂糖凝胶电泳9跳过的频带。负载5微升各样品到1.5％琼脂糖凝胶的孔中，通过凝胶5分钟运行135伏，然后120 V 20分钟。接着，孵育在DNA凝胶染色的凝胶在室温30分钟。使用可视化图像软件带。
   2. 使用凝胶提取试剂盒切除感兴趣的乐队。
      1. 切除的DNA片段，并用溶解200微升NTI / 100毫克胶凝胶片。让这坐了5到10分钟，在50℃水浴。然后转移硅胶膜管。
      2. 离心在11000 XG 30秒。符合CE前700微升NT3缓冲液洗两次在11000 xg离心再次ntrifuging 30秒。
      3. 通过在11000 xg离心离心1分钟干燥该二氧化硅膜。
      4. 添加15 - 30微升网元缓冲器，并允许它在RT静置1分钟。然后，离心在11000 xg离心1分钟。除去硅胶并保持内容在管。
   3. 用测序试剂盒，根据制造商的协议来确定序列。

3.肌内注射或Open肌活检

1. 对于生存在手术过程中维护无菌条件下，在围绕手术部位（后肢）的区域使用指甲刀去除毛发。使用碘伏或氯己作为消毒剂。通过放置，并在整个动物和手术台确保他们使用的手术部位消毒布帷。
   1. 穿着清洁磨砂，口罩，头罩，无菌手套，特种鞋手术室^52,53。
   2. 注入CXMD犬与20mg /硫喷妥钠公斤麻醉它们。使用对眼睛兽医软膏，以防止眼睛干燥。
   3. 使用2 - 3％异氟烷吸入维持全身麻醉（ 图3）。检查肌肉反射和心脏监测和呼吸率来评估麻醉深度。正常的呼吸频率（RR），心脏率（HR）和_血氧饱和度在全身麻醉下如下:RR:10 - 20次/ min; _血氧饱和度:95 - 100％，HR:80 -每分钟（BPM）120次。
   4. 使用手术刀，切开皮肤在颅胫骨扫描（CT），也被称为胫前（TA），并且使单个切割纵向大约5厘米（对年轻成年犬）。为了纪念注射部位，用手术针和手术缝合线深筋膜并以2厘米的间隔提出两个针标记。
   5. 注入AON的所需浓度与一个27克针的肌肉。所需concentration处理条件之间变化。对于CT，得到1- ml，此每两次注射，总共为1.2毫克鸡尾酒办（0.4毫克每PMO）或0.4毫克鸡尾酒vPMOs的（0.13毫克每vPMO）。为尺侧腕伸肌（ECU）的前肢肌肉，注入的各0.5毫升双卷，共1.2毫克鸡尾酒办（0.4毫克每PMO）或0.4毫克鸡尾酒vPMOs的（0.13毫克每vPMO）。留在针1分钟。使用每个AON等量的鸡尾酒。
   6. 用手术刀从CT肌肉取下一块肌肉组织的长度约两厘米见方执行开放肌肉活检。
   7. 转到步骤6.5肌肉样品制备。
   8. 用针，从全身麻醉觉醒之前管理的0.02毫克/公斤盐酸丁丙诺啡肌肉注射。莱肌肉筋膜和皮肤背部肌肉过度使用3-0可吸收线和3-0尼龙线的肌肉筋膜和皮肤缝合，缝合respectiv这些伊利。
   9. 按住嘴巴张开，确定咽反射是否已经返回;咽反射返回时，拔管狗。
   10. 通过静脉内或肌内注射施用15至30毫克/长达3天千克头孢唑啉或头孢氨苄（抗生素），以防止感染。
   11. 七天内取出缝线。直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧和不允许，直到完全恢复是由狗与其他动物进行互动不要让狗无人看管。保持气管导管的地方，只要可能，当动物开始咀嚼或吞咽删除它们。监控动物的心脏速率，呼吸和水分，以确保它们是稳定和正常的范围之内。
   12. 对于手术后的护理，3天（ 例如 ，丁丙诺啡0.01毫克/千克）和护理支持，包括一个安静，黑暗的安息之地，适当的伤口包扎和维护，软提供镇痛搁置面，补液用口服或肠胃外的流体，和通过使用高适口性的食物或治疗恢复正常喂养。如果任何动物所需要的额外的药物，给予的取决于疼痛症状0.3毫克/千克酒石酸布托啡诺的肌内注射。
       注:在痛苦的狗会咬，划伤，或保护区疼痛，如果处理，可能是不寻常的担心或攻击。此外，痛在一肢通常会导致跛行或患肢与尝试使用它拿着行动。在这种情况下，得到的0.02毫克/公斤的盐酸丁丙诺非的每6肌内注射 - 8小时。

   4.全身注射

   注意:此过程可以重复每周或每两周数周的期望数量。

   1. 通过让狗躺下手动，轻轻地抑制狗，然后双臂垂坠在肩膀和臀部在整个T下保持狗的地方他的程序。
   2. 注入的AON; 120 - 240毫克/公斤的鸡尾酒办（40 - 80毫克每AON），使用静脉留置针插入一个肢体静脉（称为头侧或隐静脉）。 AON的注射量取决于实验条件。使用每个AON等量的鸡尾酒。
   3. 使用输液泵或注射器驱动器以2.5毫升/分钟的速率注入50毫升总20分钟，按照制造商的说明进行操作。重复注射每周或每两周（每两周）至少5倍，如肌营养不良蛋白表达将与重复注射积累。
   4. 进行血液检查每周检查毒性。
      1. 用针管，收集3毫升血液 - 0.5毫升全血计数（CBC）和2.5毫升他人 - 来自前后肢或的皮下静脉之一。包括CBC，γ-谷氨酰转移酶（GGT），谷草转氨酶（AST），尿素氮（BUN），丙氨酸aminotransferase（ALT），肌酸激酶（CK），和肌酐评估测试采集的血液时，以下从血液测试成套工具制造商的说明^。40,54

   5.狗的临床分级

   1. 设置一个视频摄像头，记录狗的行为和步态。录制作为分级的狗时，这将作为一个参考的狗整个相遇;这意味着每个视频将取决于狗的能力和意愿不同的长度。使用默认录制参数。拍摄创建因此它可以在日后进行审查分级的记录。
   2. 等级步态和运动障碍。
      1. 对于步态和运动障碍，请使用以下等级:
         1级=无，2级=坐在后肢延长，3级=兔子一跳后肢，4级=洗牌的步行路程，5级=无法行走。
      2. 对于流动性的干扰，请使用以下等级:1级=无，GRADE 2 =躺着超过正常值，3级=的后肢，4级不能跳=难度加大走动，和5级=无法起床走动。
   3. 时间需要多长时间狗操作15米测量出15μm时，放置在起跑线上的狗，并鼓励它，直到15米大关运行。
   4. 确定使用以下分级量表肢体的肌肉萎缩:
      1级=无，2级=可疑的硬度，3级=可以感觉到硬度或将出现3年级和5之间薄，4级=和5级=非常薄或坚硬。
   5. 流口水使用级以下等级:1级=无，2级=坐位时，3级=有些流口水的时候吃，喝，4级=口水串进食或饮水时，和5级=连续流口水偶尔滴下的口水。
   6. 使用以下规模的舌头（巨舌症）的肥大等级:1级=无，2级=略有放大，3级=延长outsi德牙列，4级=放大和稍增厚，以及5级=扩大，增厚。
   7. 甲级狗的使用下列标准吞咽能力:1级=无难度，2级=花费的时间和精力进食，3级=难度在进食从板咀嚼，四年级=困难，吞咽或饮水和5级=吃不下。
   8. 通过从每个类别添加分数（除了15米运行试验^）55计算总等级。
      注意:研究应该盲以免引入偏倚。

   6.磁共振成像（MRI）

   1. 使用3特斯拉（3T）核磁共振和18厘米直径的/ 18厘米长的人下肢线圈以获得后肢的T2加权的图像。
   2. 通过用20毫克/千克硫喷妥钠注入CXMD狗麻醉动物。使用对眼睛兽医软膏，以防止眼睛干燥。使用2-3％异氟烷吸入维持全身麻醉。
      1. 检查肌肉反射和心脏监测和呼吸率来评估麻醉深度。正常的呼吸频率（RR），心脏率（HR）和_血氧饱和度在全身麻醉下如下:RR:10 - 20次/分， _血氧饱和度:95 - 100％，HR:80 -每分钟120次（BPM ）。
   3. 使用下面的设置来获得T2加权像:TR / TE = 4000/85毫秒，切片厚度为6毫米，层间距= 0毫米，鉴于=18厘米领域×18厘米，矩阵大小= 256×256，快速自旋回波（ 图4）期间采集= 3的数。

   7.肌肉取样和准备（尸检）

   注:应肌肉一两个星期的最后AON注射后进行采样。

   1. 注入与20mg狗/硫喷妥钠公斤麻醉它们。麻醉期间对眼睛使用兽医软膏，以防止眼睛干燥。
   2. 使用2 - 3％异氟烷吸入维持ANESthesia。检查肌肉反射和心脏监测和呼吸率来评估麻醉深度。正常的呼吸频率（RR），心脏率（HR）和_血氧饱和度在全身麻醉下如下:RR:10 - 20次/ min; _血氧饱和度:95 - 100％，HR:80 - 120 BPM。
      1. 安乐死在全身麻醉下放血的狗（仅用于尸检）。使用下深全身麻醉放血以避免由在分子分析血液衍生的因素（ 例如 ，心脏肌肉）的影响。
   3. 解剖下面的肌肉（ 图5）:CT，趾长伸肌（EDL），腓肠肌，比目鱼肌，股二头肌，股直肌，肱二头肌，肱三头肌，三角肌，ECU，伸腕桡（ECR），尺侧腕屈肌（FCU ），桡侧腕屈肌（FCR），股薄肌，肋间肌，腹肌，膈肌，肌外侧，食道，胸锁乳突肌和心脏。为了检验毒性，肾收集和李版本的样品。使用埃文斯和亚历山大·德Lahunta（2009）作为解剖技术⁵⁶的参考。
   4. 切CT，EDL，腓肠肌，比目鱼肌，股二头肌，股直肌，肱二头肌，肱三头肌，三角肌，ECU，ECR，FCU，FCR，股薄肌，肋间肌，腹肌，侧肌，食道，胸锁乳突肌，心脏，肾脏，和肝成小部分约1 - 以长1.5厘米滚动膈肌上升，然后将其切成1 - 1.5厘米第^56。
   5. 放置黄蓍胶，以便它是约0.5 - 对软木盘厚1厘米。标签的光盘上的黄蓍胶的相对侧上的动物的鉴定和肌肉名称。
   6. 放置与它们的纵向轴线的肌肉垂直于黄蓍胶的软木。
   7. 放置瓶塞在被坐于液氮的异戊烷的容器。周围不断用镊子将其移动，持续1分钟或直至完全冻结。软木塞上的肌肉商店在-80℃下的小瓶中。运输时，放干冰的小瓶。
   8. 制备标记的动物识别/肌肉名和日期载玻片上。
   9. 在低温恒温器冷却到-25℃，装入软木到支架。设置部厚度至所需水平。使用8微米的免疫组化和12微米的苏木精伊红（HE）染色。使用15微米的Western blot检测样品。修剪肌肉约四分之一，以获得适当的肌肉取样平坦的肌肉。
   10. 同时切割肌肉的一个部分，放置在同一载玻片上，每6 ^个部分，如果计划使用的样本进行免疫组化和HE染色。如果使用的样品进行Western印迹，把30 - 40段中的管并储存于-80℃。
   11. 制备的幻灯片之后，让载玻片干燥在RT 1.5小时。商店在幻灯片-80℃。

   8.免疫组化

   1. 从存储器中取出准备好的幻灯片，并放置在湿气室内保持分离幻灯片和保持水分。填充湿气室，使得底部正好覆盖有水（大约1的水毫米）。
   2. 风干0.5小时。画一个正方形内附使用疏水屏障笔幻灯片肌肉样本。
   3. 添加15％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在室温孵育2小时，以封闭试剂。
   4. 添加抗肌营养不良蛋白杆域（DYS-1）小鼠单克隆第一抗体，或C-末端的单克隆抗体（DYS-2），用于狗肌营养不良蛋白染色（1:150稀释）。稀释1.25毫升的PBS使用封闭剂。孵育O / N在冰箱4℃。
   5. 用PBS洗涤5分钟，重复三次。加入第二抗体Alexa的594山羊抗体抗小鼠IgG1（DYS为-2）或IgG2的（对于DYS-1）（1:2,500）。用在PBS中封闭剂含有0.1％辛基酚乙氧基化物稀释。在室温下孵育0.5小时。
   6. 用PBS洗涤5分钟，3吨输入法。允许滑动晾干。加入1 - 2滴4（3纳克/毫升）'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的安装的解决方案。使用镊子，将一个玻璃滑移过的章节的顶部，避免气泡。
   7. 视图dystrophin-（DYS-1 / DYS-2）在594纳米处20X放大率在荧光显微镜下阳性纤维。

   9.免疫印迹

   1. 从冷冻切片在冰上150微升样品缓冲液添加收集肌肉部分。
   2. 用一只手均质，均质短暂的蛋白样品。热样品在1.5ml管中的加热块培养箱中于95℃，3 - 5分钟。离心机在16500×g的15分钟，并收集上清液。
   3. 在-70℃的上清液商店等分试样。用蒸馏水稀释至100倍。
   4. 使用根据制造商的协议商业试剂盒确定蛋白质浓度。 2×Laemmli的SDS加载缓冲液添加到样品和热3分钟＆＃160;在95℃。
   5. 负载样品分为3 - 8％Tris-乙酸盐凝胶运行它在150五3小时之前包括若干稀野生型（WT）的样品（ 例如 ，1％，10％和50％），为定量。肌营养不良蛋白的小于1％的野生型水平应用这种方法来检测。
   6. 放置在阴极缓冲凝胶20分钟。在此期间，采取九片滤纸，并把它们在传输缓冲器（3篇在阴极缓冲液[+]，阳极缓冲液（[ - ]，浓缩的阳极缓冲液[ - ]，分别）此。描述了一种提高灵敏度（ 图6）半干转移方法。
   7. 在甲醇中浸泡的PVDF膜20秒，然后放置在阳极缓冲。
      设置与膜为半干转移的凝胶，并允许它在室温或在冷室中运行以400mA 1.5小时。
   8. 用PBS洗膜。在PBS中的吐温20（PBST）和5％奶粉2小时的混合物中孵育该膜。
   9. 在PBST中稀释DYS-1（第一抗体）和5％奶粉的混合物以1:100稀释。将其添加到该膜，并让它温育至少1小时。洗用100ml PBST清洗3次，每次15分钟。
   10. 1添加65微升/ HRP结合的二级抗体（抗小鼠IgG2a为DYS1）车道:5000稀释液在室温在暗处1小时。然后，洗净用用200ml PBST三次20分钟。混合从检测试剂盒解决方案遵医嘱。孵育1分钟。
   11. 开发薄膜检测带和ImageJ的软件^48,57,58分析。

结果

在体外 实验

成肌细胞，以比较各AON的效力与各种2'OMePS处理条件转染。每个Ex6A，Ex6B，Ex8A或EX8B的600纳米单AON的治疗做了，以及与所有每4 AON序列600nm的鸡尾酒疗法。 RNA样品转染四天后收集。的RT-PCR后，对于每一个处理的样品上的凝胶与未处理（NT）的样品一起运行。在凝胶上频带更高代表外的帧的DMD的产品;这些频段被认为在NT，Ex8A和EX8B处理成肌细胞。 Ex6A，Ex6B，Ex8A和鸡尾酒治疗的成肌细胞表现出帧的产品。鸡尾酒和Ex6A / B显示100％的符合读框的产品，而Ex8A表明只有30％在帧产物（ 图7）。为了证实外显子跳跃和恢复阅读框，进行cDNA的测序;结果表明，外显子6 - 9确实被跳过（ 图7）。免疫组化显示AON处理过的狗相比，NT样品（ 图8）提高抗肌萎缩蛋白阳性纤维。

体内 实验

以比较各AON处理条件的效率，CXMD狗（0.5 - 5岁）用1.2毫克Ex6A或在不同剂量Ex6A，Ex6B和Ex8A的鸡尾酒一次注射。注射后两周，收集肌肉样品并用DYS-1染色以比较抗肌萎缩蛋白阳性纤维的数量。相比于NT样品所有鸡尾酒治疗的样品显示增加dystrophin的表达。肌营养不良蛋白阳性纤维增加了与AON剂量（ 图9）。继系统集成电路注射，野生型（WT），NT和鸡尾酒治疗CXMD肌肉样品用DYS-1（ 图10）染色。相比于NT CXMD狗鸡尾酒治疗CXMD狗显示增加抗肌萎缩蛋白的表达，心脏肌肉标本无论是在CT和。然而，AON处理骨骼肌（CT）表现出相比治疗心肌肌营养不良蛋白的高得多的表达。 WT相比，NT和各种鸡尾酒吗啉治疗肌肉免疫印迹导致了同样的结论。也有一个大的范围内，处理过的骨骼肌样品中肌营养不良蛋白的表达（ 图10）。伊红（HE）染色显示治疗CXMD 狗表现出改进的组织病理学，以相比于NT CXMD犬（ 图11）在中心的核纤维（CNF）一个显著下降。这表示有更变性/再生在NT狗发生，肌营养不良病理学的迹象。此外，治疗的狗有更快在临床分级量表运行时间和提高分数。治疗CXMD狗表现出比在所有类别NT CXMD狗（ 图12）成绩更好。

图1. CXMD狗和6外显子突变模式- 8跳过策略使用反义鸡尾酒 CXMD狗在6号外显子的点突变导致外显子7的营养不良的狗基因的损失。这导致的mRNA被外的帧和抗肌萎缩蛋白的生产损失。短AON序列被设计成结合外显子6和8，这导致mRNA剪接有效跳过外显子6 - 8中的AON鸡尾酒治疗的狗的灰色条表示短AON序列。外显子9编码铰链结构域，有时自发地与的AON剪接掉针对外显子6和8所得的mRNA编码肌养属于短蛋白但功能人。 请点击此处查看该图的放大版本。

一个1岁的犬X连锁肌营养不良症（CXMD）动物的图2，主要临床症状。一个1岁的野生型小猎犬和CXMD狗所示。近端，四肢和颞肌的参与通常是从2月龄观察。关节挛缩和骨盆的转移是从4个月的年龄明显。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3.全身麻醉的狗。A）Intramuscul芳注射和肌肉活检用异氟烷麻醉下进行。 B）保持动物全身注射。 请点击此处查看该图的放大版本。

野生型的图4的磁共振成像（MRI），未处理CXMD，和治疗CXMD。后肢的MRI扫描3个月，并在野生型和NT CXMD犬5个月。和AON的注射后（第一次注射前1周）处理CXMD后肢核磁共振预两个样本图像被示出。 2703MA后处理7倍每周用200毫克/公斤鸡尾酒吗啉。 2001MA用120毫克/千克的鸡尾酒吗啉每周5次静脉注射治疗。控制和治疗的狗是年龄匹配。治疗的狗秀降低T2信号。图像ADAP泰德与横田等人的许可。（版权2009年，约翰·威利父子^）40 请点击此处查看该图的放大版本。

图5.肌活检程序一只狗。A）下肢固定肌肉活检。 B）用钳子的帮助下，下肢被保持。 C）中的CT肌肉露出。开放式活检技术被用来获得注射部位的肌肉样品。线程是用于保存活检标本。在解剖后，黄蓍胶D）肌肉样品。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图6.半干传输方法。对于Western印迹半干转移法的代表性提出。浓缩阳极缓冲浸泡三篇论文在负极端子放下; 3篇论文在阳极缓冲浸泡堆积在此之上。 MB的PVDF纸张上的6篇论文的顶部被解雇之前，浸泡在甲醇中，然后阳极缓冲。凝胶，已浸泡在阴极缓冲，是在PVDF纸轻轻地敷设。最后，3篇在阴极缓冲浸泡被放置在凝胶的顶部。正极端子被设置在顶部。 1小时400毫安通过系统运行。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7.外显子跳跃在CXMD成肌细胞。 CXMD成肌细胞与Ex6A，Ex6B，Ex8A，或单独EX8B，或所有四个鸡尾酒转。总共600纳米的被用于单独序列和用于鸡尾酒中使用的各序列的600纳米。 A）在CXMD狗成肌细胞2'OMePS治疗。 Ex6A，Ex6B和鸡尾酒治疗的样本显示在画面外显子跳过的成绩单预期位置强带。 Ex8A示出了中间波段，EX8B示出了弱带，和NT不会在框内位置显示的频带。 B）基因测序单从Ex6A，转染后4天。图像是从横田等人改编许可（版权2009年，约翰·威利父子^）40。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8.增加Dystrop在2'O甲基化硫代磷酸酯（2'OMePS）欣表达转染成肌细胞CXMD。CXMD成肌细胞单独Ex6A或鸡尾酒2'OMePS染。 DYS-2（红色）和DAPI（蓝色）染色被示出。处理过的成肌细胞进行比较，以野生型（WT）和未处理（NT）成肌细胞。图片适于与横田等人的许可。（2009年的版权，约翰·威利父子^）40。酒吧= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9.救援与吗啉的肌内注射在单独CXMD狗。要么Ex6A或Ex6A，Ex6B和Ex8A的鸡尾酒肌营养不良蛋白表达的注入CXMD狗的CT肌肉。野生型肌营养不良蛋白（DSY-1）染色（WT），未处理的（NT），并且处理CXMD狗被示出。狗要么单独1.2毫克Ex6A或1.2毫克鸡尾酒治疗。图片适于与横田等人的许可。（2009年的版权，约翰·威利父子^）40。酒吧= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

染色用图10.提高抗肌萎缩蛋白表达系统性鸡尾酒吗啉治疗CXMD狗。抗肌萎缩蛋白（DYS-1） 在野生型（WT）（阳性对照）比较抗肌萎缩蛋白的表达，未治疗（NT）（阴性对照）和CXMD犬120毫克/千克吗啉混合物（40毫克/千克每AON的）处理。啉混合物含有Ex6A，Ex6B和Ex8A。狗静脉注射5次，我们这种鸡尾酒ekly。 A）在WT，NT颅胫骨（CT）肌营养不良蛋白的表达，和治疗狗的比较。 B）dystrophin的表达NT和吗啉鸡尾酒治疗犬之间的心脏组织中的比较。 C）免疫印迹与结蛋白作为内参抗肌萎缩蛋白显示为WT，NT和吗啉鸡尾酒治疗犬。下面的肌肉示为治疗的狗:肱三头肌（TB），肱二头肌（BB），隔膜​​（DIA），食道（ESO），CT，内收肌（ADD），趾长伸肌（EDL），咬肌（MAS），和心脏。图片适于与横田等人的许可。（2009年的版权，约翰·威利父子^）40。酒吧= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

数字11. CXMD狗改进组织病理治疗7周240毫克/千克吗啉鸡尾酒。CXMD狗从半年到五岁，用240毫克/千克吗啉鸡尾酒（Ex6A，Ex6B和Ex8A）静脉注射一次周7周。在最后一次注射后14天，取食道肌肉和苏木精和曙红（HE）染色已完成。来自未处理（NT）食管肌肉HE染色和吗啉鸡尾酒治疗（处理）CXMD狗（40X物镜）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图12.临床分级改进成绩和15 m跑时间吗啉治疗。吗啉处理后的狗进行了比较，未处理（NT）同窝秒。图中的误差棒表示SEM。 A）在临床分级考试的总成绩获得了治疗前后计算处理的动物与NT同窝进行了比较。 B）的处理和NT的狗为15米运行时间比较。 C）到B类似;然而，使用了更加年轻的狗。图像是从横田等人改编许可（版权2009年，约翰·威利父子^）40。 请点击此处查看该图的放大版本。

反义寡核苷酸	核苷酸序列
Ex6A	GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG
Ex6B	ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT
Ex8A	CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC

表1.反义寡核苷酸设计。

讨论

外显子跳跃是DMD的治疗有希望的治疗方法。 在体外和体内实验表明多外显子跳跃是可行的。这里，使用了CXMD狗模型的讨论。 8.用于CXMD成肌细胞的转染和被选择用于体内实验啉AON骨干化学的2'OMePS AON化学-第一，的AON被使用Rescue-ESE和ESEfinder方案靶向肌营养不良蛋白外显子6的设计。 vPMOs比未修饰的办更有效，但由于其较高的毒性它们并不适于全身注射。 RNA提取，RT-PCR和cDNA测序对CXMD成肌细胞进行。与PMO鸡尾酒注入狗在临床分级评估临床症状的任何改善。狗被安乐死后，肌肉取样并用于冷冻切片制备。抗肌萎缩蛋白的半衰期由A诱导寡核苷酸被认为是约1 - 2月。年轻的成年犬在该研究中使用，虽然这些实验可与新生儿狗和老年犬（> 5岁）进行。准备肌肉切片用于组织病理学评估，并通过免疫印迹和免疫组化⁴⁸评估抗肌萎缩蛋白抢救。

以确保PMO溶液的体积是打针之前正确是很重要的;不这样做会对结果显著的影响。期间肌内注射，需要足够的压力，进入肌肉纤维。狗的健康和手术部位的检查监督是重要的疑难解答。并监控动物健康，每周验血和称重应该执行。动物和制备肌肉样品的安乐死后，为了保证在检测肌养蛋白的灵敏度的一个关键步骤是同时使用Tris-乙酸盐凝胶和半干印迹方法Western印迹过程期间。

正如代表结果显示，成肌细胞与帧DMD产品生产Ex6A，Ex6B，Ex8A和鸡尾酒（含Ex6A，Ex6B，Ex8A和EX8B）处理。因为EX8B不产生外显子跳跃的制品，它没有在随后的体内实验使用。基因序列分析表明外显子6 - 9跳绳​​发生和免疫细胞化学与DYS-2染色显示恢复处理的样品中dystrophin的表达。 AON处理的狗表现出肌营养不良蛋白阳性纤维的显著增加。这表明，外显子6 - 8分别被跳过，并缩短蛋白质生产。当使用AON的鸡尾酒肌营养不良蛋白阳性纤维的量增加，是成正比的AON剂量。免疫印迹显示，全身吗啉，治疗的狗增加dystrophin的表达。骨骼肌有肌营养不良蛋白纤维的可变的水平;然而，吗啉治疗心脏组织不大提高抗肌萎缩蛋白的表达。由于肌营养不良蛋白具有高的分子量（427 kDa）的，低量的抗肌萎缩蛋白的检测是困难的。为获得最佳效果，Tris-乙酸凝胶和半干转印法中使用。 HE染色显示啉治疗犬提高组织病理学。中央成核的纤维（的CNFs）是不健康的肌肉的标志，代表肌肉变性和再生的循环。吗啉处理CXMD狗表现出相比于未处理CXMD狗的CNFs的百分比的降低。临床分级揭示症状，如增加行走和奔跑能力，在吗啉处理的动物的改善。肌肉的硬度被认为是反映肌肉萎缩，因此，它被列入评级制度^59。大腿（后肢）肌肉的硬度进行评价;然而，我们排除颅缝匠肌，因为它们往往表现出在CXMD肥大而非萎缩。治疗的狗显示编较低分级分数，并在15米跑测试中的速度更快倍。在15米的测试改进的时间是指示性改善肌肉功能^40。较高的整体分数等级表示健康状况不佳，增加肌肉萎缩。

虽然这些结果是有希望的，多外显子跳跃仍然存在，这将需要克服的技术具有临床适用性之前许多挑战。心脏组织仍显示减少的AON，可能摄取是由于心脏和骨骼组织的细胞运输的差异。无毒性作用下当前的给药方案动物身上观察到;然而，更多的工作需要做评估长期毒性前使用的AON鸡尾酒可以移动到临床试验。这是很难获得批准的AON鸡尾酒药物因为监管机构定义每个AON序列作为唯一的药物。这意味着，在一个鸡尾酒每个序列需要为萨费特单独测试Y，需要更多的时间和更多的钱。另一个障碍在临床环境中使用的多外显子跳跃的是大量的具有未知功能产生的中间的蛋白质产物。这些蛋白可以潜在导致不可预测的副作用，根据个体突变^22。此外，目前的营养不良狗模型中可用的突变模式是有限的。很少有天然存在的突变，而不是所有的突变是用于研究多外显子跳跃是有用的。营养不良的动物模型有望成为未来DMD外显子跳跃的研究^33，34一个很好的选择。

在DMD狗模型比其他模型DMD一定的优势。作为一个更大的动物模型，临床分级和MRI是可能的，允许更详细的分析。自狗是大型动物他们也更适合于毒理学研究和更紧密地代表相比于小鼠模型的人类疾病。狗米odels还具有更类似于人类^23，34，45 DMD基因序列。

虽然技术上具有挑战性的，多外显子跳跃的方式可能最终受益的> 90％的患者DMD ^24。这使得一个更好的选择为单外显子跳跃，如单外显子跳跃只适用于患者的一小部分。此外，多外显子跳跃将使我们能够选择优化缩短的dystrophin蛋白的功能缺失模式。例如，DMD的外显子缺失45 - 55与异常症状轻微或无症状个体^14,19,60-63有关。外显子45的多外显子跳跃- 55已被证明在DMD的使用的vPMOs ^22,26全身注射的外显子52缺失（mdx52）小鼠模型。使用鸡尾酒​​vPMOs也已经证实在其它形式的肌营养不良症，例如福山先天性肌营养不良症（FCMD）。 FCMD由外显子捕获，其中异常mRNA剪接是由逆转录转座子的插入引起的。 vPMOs已经显示营救拼接图案中既是FCMD小鼠模型和在人类细胞系^64。下一代的AON化学呈现更高的功效和较低的毒性将有助于多外显子跳跃的方法投入临床应用的有效的翻译。此外，多外显子跳跃可能被应用到其他遗传疾病，如dysferlinopathies ^24，65。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2'OMePS Transfection of Dog Myoblasts
3 ml 6-well plates	IWAKI	5816-006
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	11965-092
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SH30071.01
Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333	200 U/ml
Lipofectin	Invitrogen	18292-011	Total volume of 100 ml in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin.  10 ml lipofectin for 5 mg RNA.
2’OMePS	Eurogentec		Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).
Horse Serum	Gibco	16050-114	2%
streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	200 μg/ml
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Insulin
Morpholino transfection of dog myoblasts All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts for culturing
Antisense morpholinos	Gene-tools		Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),  Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)                           Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.                   120–200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/ml in saline
Endo-Porter	Gene-tools
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Invitrogen	15596-018	1 ml/plate
RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Invitrogen	15596-018	1 ml/plate
Chloroform	Sigma-Aldrich	P3803	200 μl
1.5 ml Tubes	Eppendorf	22363204
Centrifuge	Beckman-Coulter
75% Ethanol	Sigma-Aldrich	34852
UV Spectrometer
Forward primer in exon 5	Invitrogen		CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA                           1.5 μl 10 μM
Reverse primer in exon 10	Invitrogen		TGCTTCGGTCTCTGTCAATG                             1.5 μl 10 μM
dNTPs	Clontech	3040
One-Step RT-PCR kit	Qiagen	210210
Thermo-cycler	Scinco
Complementary DNA (cDNA) Sequencing
Gel extraction kit	Qiagen	28704
Centrifuge
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystems	4337454
Intramuscular injections or open muscle biopsy
Surgical Tools			Scissors, scalpel, needle, surgical thread
Vet Ointment
Iodophors	webtextiles	12190-71-5
chlorohexidine	Peridex	12134
Surgical Drapes
Scrubs
Facial Mask
Surgical Gloves
Head Covering
Thiopental sodium	Mitsubishi Tanabe Pharma		20 mg/kg
Isoflurane	Abbott laboratories	05260-05	2-3%
Antisense morpholinos	Gene-tools		Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),  Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)                           Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media.                   120–200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/ml in saline
27 G Needles	TERUMO	SG3-2325
50 ml syringe	TERUMO	SG2-03L2225
buprenorphine hydrochloride
Tongue Depressor
cephalexin		15 to 30 mg/kg
cefazolin		15 to 30 mg/kg
buprenorphine		0.01 mg/kg
buprenorphine hydrochloride	0.02 mg/kg
Systemic Injections
Syringe infusion pump	Muromachi
22 G Indwelling needles	TERUMO	SG3-2225
27 G Needles	TERUMO	SG3-2325
50 ml syringe	TERUMO	SG2-03L2225
Saline	Ohtsuka-Pharmaceutical	28372
Clinical Grading of Dogs
Video Camera
Stop watch
Magnetic resonance imaging (MRI)
3 Tesla MRI l
18 cm diameter/18 cm length human extremity coil
Muscle sampling and preparation (necropsy)
Thiopental sodium	Mitsubishi Tanabe Pharma		20 mg/kg
Isoflurane	Abbott laboratories	05260-05	2-3%
Tragacanth gum			10-20 ml
Liquid Nitrogen
Cork Discs	Iwai-kagaku	101412-806
Dry Ice
Tweezers
Poly-L-lysine–coated slides	Fisher	22-037-216
Cryostat Microsystem	Leica		cm1900
Immunohistochemistry
DYS1	Novocastra	NCL-DYS1	1:150 dilutions
DYS2	Novocastra	NCL-DYS2	1:150 dilutions
Alexa 594 goat antimouse IgG1	Invitrogen	A-21125	1:2,500 dilutions
Alexa 594 goat antimouse IgG2	Invitrogen	A-11005	1:2,500 dilutions
DAPI	Invitrogen	D1306	Contains mounting agent
Goat Serum	Invitrogen	10000C	15%
PBS
Moisture chamber	Scientific Devise Laboratory	197-BL
Chamber slide	Lab-tek	154453
Cover Glasses	Fisher	12-540A
Hydrophobic barrier pen
Fluorescent microscope			594 nm at 20X magnification.
Western Blotting
Distillied Water
Hand Homogenizer
2× Laemmli SDS-loading buffer			0.1 M Tris–HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue
SDS gels	Bio-Rad	161-1210	5% resolving
SDS gels	Invitrogen	Invitrogen, WG1601BOX	3-8%
PVDF membrane	GE	10600021
Methanol
Running buffer (10×)			250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine
Running buffer (1×)			10% 10× buffer, 20% methanol
0.05% PBS/Tween 20 (PBST)			2,000 ml               3× 200 ml for washing
PBST/5% milk powder			100 ml
Protein Assay Kit	BCA	T9650
Tween 20	Sigma	P5927
Urea	Sigma	U5378
Beta Mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E
SDS	Sigma	L3771
Tris-Acetate	Sigma
Tris HCl	Sigma	T3253
Glycerol	Sigma	G8773
Loading/sample buffer for Western blotting	NuPage Invitrogen	NP007
NaCl	Sigma	S3014
PMSF	Sigma	P7626
Protease cocktail inhibitor	Roche	11836153001
Cathode Buffer			0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol
Anode Buffer			0.03 M Tris Base + 20% Methanol
Concentred Anode Buffer			0.3 M Tris base + 20% Methanol
desmin antibody	Abcam	ab8592
DYS1	Novocastra	NCL-DYS1	1:150 dilutions
ImageJ Software