功能互补分析（FCA）:实验室练习设计和实施，以补充生化途径的教学

摘要

所涉及的生化途径的酶活性的确认可以使用功能性互补分析（FCA）阐明。描述在这个手稿是FCA测定表明参与氨基酸，细菌严格的响应和细菌的肽聚糖的生物合成的代谢酶的酶活性。

摘要

功能互补测定（FCA）是一种体内测定，被广泛用来阐明基因/酶的功能/作用。这种技术是很常见的生物化学，遗传学等众多学科。该技术的全面介绍，以补充有关氨基酸，肽聚糖和细菌严格的响应在这个手稿报道的生化途径的教学。从所涉及的赖氨酸（L，L-二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）以及参与酪氨酸和苯丙氨酸的代谢酪氨酸转氨酶（tyrB）的代谢模式植物生物体拟南芥两个cDNA被突出显示。另外，细菌肽聚糖合成代谢途径是通过UDP-ñ-acetylmuramoyl基-L-丙氨酰-D- glutamate- 消旋 -2,6-二氨基庚二酸连接酶（MURE）基因从参与跨细菌Verrucomicrobium棘的分析突出-linking肽聚糖。细菌严格的响应也通过RSH（R ELA / s的锅ħomolog）负责在细菌Novosphingobium藻一个超粘液型双功能基因的分析报告。FCA的四个实例。视频将专注于他们三个，分别是赖氨酸，肽聚糖和严格的响应。

引言

在基因的阐明功能（多个）/角色（多个）的上下文功能互补被定义为一个特定的同源或直系同源基因的当同源与观察到的表型来恢复一个特定的突变体与野生型状态的能力或直系同源基因在顺式或反式引入突变体背景。这种技术已被广泛地用于分离和鉴定的功能（多个）的许多基因的/角色（多个）。一个具体的例子是使用S的URA3突变的白色念珠菌乳清苷-5'-磷酸脱羧酶的分离和鉴定酵母和大肠杆菌的的pyrF突变体大肠杆菌 ¹的作者已经使用此技术来阐明所涉及的氨基酸，肽聚糖和在他们的研究方案的严格响应代谢后，已把该技术进在B的教学计划的基因的功能艾讴和分子生物学（BMB）在罗切斯特技术学院（RIT）程序。

笔者教植物生物化学/病理学（FPBP）（哈德森）和生物分离的基本原理:原理与实践（BPP）（哈德森/ Savka），在BMB计划在RIT两个上师选修课实验室为主的课程。由于一些那是在课程中讨论的主题与他们的研究兴趣关联，作者纳入了许多了在各自的研究项目中使用到这两个基于实验室的课程，技术和实验工具。一个这样的例子是功能互补作为实验室锻炼来加强涉及氨基酸从植物，肽聚糖和从细菌中严格的响应代谢酸代谢的演讲材料。

从植物是在FPBB过程所讨论的氨基酸途径的三个是赖氨酸（Lys）的，酪氨酸（TYR）和苯丙氨酸（Phe）。的赖氨酸途径中强调过程，因为氨基酸的作为必须氨基酸对所有动物特别是人的重要性，因为动物缺乏遗传机械合成赖氨酸从头 。另外，最近发现，植物采用为赖氨酸的合成在与细菌显著不同的路径。这个发现是部分地由大肠杆菌的功能互补促进大肠杆菌二氨基庚二酸（DAP）使用从模型植物拟南芥编码酶L，L-二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）的基因的突变体^。2为通过中间二氨基庚二酸赖氨酸的合成的变体途径示于图1中 。另外，赖氨酸的合成通过氨基酸的天冬氨酸衍生的家族是高度调控便于³除了其重要性的蛋白质SYNThesis，对于TYR和苯丙氨酸的途径是高亮鉴于其重要性，作为前体化合物服务于苯丙化合物的合成代谢参与植物防御化合物，如合成:生物碱，木质素，类黄酮，异黄酮，等等羟基肉桂酸⁴ TYR和苯丙氨酸途径也突出显示的植物和细菌合成代谢途径之间的差异。在细菌中，酶酪氨酸转氨酶（TyrB）参与两个氨基酸的合成代谢，而在植物中，酶是主要参与酪氨酸和苯丙氨酸的代谢和不参与这些氨基酸的合成代谢。 （ 图^2）。4

革兰氏阳性和革兰氏关于肽聚糖（PG）的结构阴性菌之间的差异突出了FPBP过程。革兰氏阴性细菌的PG是基于这样的事实，关于植物病理学的利益，大多数植物病原体是革兰氏阴性。对于排名前10位的细菌植物病原体最近的检查发现，一切都是革兰氏阴性。的细菌是从属: 假单胞菌属 ， 青枯 ， 土壤杆菌 ， 黄单胞菌属 ， 欧文氏菌属 ，Xylella，Dickeya和果胶杆菌属 ⁵之一的化学差异比较革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的PG干时是交联氨基之间的差这两种类型的氨基酸。为PG的不同交联的初始步骤中的PG合成代谢的细胞质步骤发生并且被酶UDP-Ñ-acetylmuramoyl基-L-丙氨酰-D- glutamate- 消旋 -2,6-二氨基庚二酸连接酶促进（MURE） （ 图3A）。 MURE催化加成⁶肽干的第三位置。一个特定的二胺化合物在大多数革兰氏阴性细菌的，倒数第二个赖氨酸前体， 内消旋 -diaminopimelate（ 米-Dap）作为交联氨基酸和赖氨酸服务于大多数革兰氏阳性菌的PG（ 图3B）相同的作用^。7这是由于这样的事实，即两个M -Dap和赖氨酸具有两个胺基团和能够形成肽干交联两条肽键。

在生物分离:原理与实践（BPP）当然，讨论细菌的培养和水平如何营养将在这两个系统显著变化，由于环境变化开放和封闭系统之间的差异。这些事件被链接到被称为"降档"或"上移"监管的变化由饥饿或氨基酸或能源供应充足触发。当细菌培养从丰富和复合培养基转移到化学上确定的培养基用一个单一碳源可发生"下移"响应。这种变化在环境导致快速cessatRNA和rRNA的合成化。此停止导致缺乏核糖体，蛋白质和DNA合成的即使氨基酸的生物合成被上调。

继"下移"响应，现有的核糖体被用来产生新的酶合成氨基酸在培养基或环境不再可用。一段时间后，rRNA的合成和新核糖体组装和细菌细胞群开始以降低的速度虽然增长。事件的过程被称为" 严格的响应"或" 严格的控制"，并且是全球细胞调节的例子，并且可以被认为是作为一个机构，用于调节细胞的生物合成机器来补偿所需的底物和能量的需求的情况⁸的严格的响应从而使细菌迅速在环境营养素通量响应，并有助于与ENH细菌元代的环境中竞争，可以与关于营养和或基板供货迅速变化的能力^。8-9

严格的响应具有时的氨基酸，碳，氮，磷，和脂肪酸的可用性被限制在基因表达的不可或缺的作用^。8,10-14这种严格的响应是由两个核苷酸，鸟苷四磷酸（ppGpp的）和鸟苷的协调五磷酸盐（pppGpp）通常称为一起为alarmone（p）ppGpp的。例如，当氨基酸被限制 - 这可导致蛋白质合成的alarmone一个瓶颈，鸟苷3,5-（双）焦磷酸（ppGpp的），从鸟苷3-二磷酸5-磷酸的合成代谢衍生（pppGpp）累积在细胞中。在（P）ppGpp的电平的变化是参与调节响应克服缺乏直接参与细胞生长和发展在环境中基板的基因的表达吨。那些参与这一进程的基因的两个被称为RELA和现货。 RELA是核糖体相关（P）ppGpp的合成中所涉及的响应于不带电的tRNA的积累是氨基酸的限制的结果。点用作双功能（P）ppGpp的合成酶和水解酶。点的合成酶活性参与响应于缺少碳和脂肪酸饥饿⁸的RELA /点同系物是在植物和细菌广泛和被称为硫醇的R ELA / S的锅^{ħomologs。8,10 -12,16}最近手稿表明有涉及从细菌Novosphingobium藻的Rr 2-17这些alarmones合成的特定硫醇的蛋白质^。17

这里我们介绍拴在功能互补实验4生化途径。在这个手稿中概述的互补实验提供了一个渠道，以EXPL矿石采用这种体内测定为鉴定和或表征被预测为具有未知/推定功能（S）或作为教学工具来补充的生化途径的教学酶的手段。

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研究方案

注:作者愿意提供菌株和重组质粒，以促进功能互补分析，为教学目的纳入为个人谁是感兴趣。了用来促进功能互补实验的质粒列于表1。

1质粒的构建功能互补

1. 对于功能互补二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）的克隆。
   1. 从五扩增DAPL开放阅读框（ORF） 棘和cDNA的距离A.拟南芥和C.通过PCR 藻 。使用在94℃1个循环2分钟，随后为15秒的94℃30个循环，60℃30秒和72℃2分钟。包括引物各12皮摩尔，1毫用MgSO _4所示 ，每个4脱氧核苷三磷酸为0.5mM，和模板DNA为0.5ng和PFX的1个单位DNA聚合酶。
      注:从工厂A.关于三个DAPL同源重组克隆的完整描述拟南芥 （ 在 -dapL），细菌Verrucomicrobium棘 （VS -dapL）和藻类莱茵衣藻（铬 -dapL）先前已公布^。2,18-20
      注意:是用于DAPL直向同源物的克隆的引物如下:
      VS DAPL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3'
      VS DAPL - [R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3'
      在 DAPL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3'
      在 DAPL R-5'GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3'
      铬 DAPL F-5'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3'
      铬 DAPL - [R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3'
   2. 克隆PCR片段入T他质粒pET30a中，以产生重组质粒，质粒pET30a :: VS DAPL，pET30a中:: 在 DAPL以及使用该引物，限制性内切酶和T4 DNA连接酶的pET30a :: 铬 DAPL。
      1. 简单地说，孵育插入件的50纳克并在1×连接酶缓冲液20纳克载体和1单位T4 DNA连接酶过夜17℃。变换连接入E.大肠杆菌 DH5α细胞和屏幕上的LB平板的菌落在37℃下培养24小时，补充有50微克/毫升卡那霉素^{-1 18-20}
   3. 为了创建功能互补质粒，消化的pET30a :: VS DAPL和pET30a中:: 在 DAPL质粒用限制酶XbaI和SalI和XbaI和HindIII的pET30a中:: 铬 DAPL。结扎插入到使用T4DNA连接酶，以产生质粒pBAD33 :: VS DAPL质粒pBAD33; pBAD33 :: 在 DAPL和pBAD33 :: 铬 DAPL。
      1. 插入孵育50毫微克至20毫微克的在1×连接酶缓冲液矢量和1单位T4 DNA连接酶过夜17℃。变换连接入E.大肠杆菌 DH5α细胞和屏幕上的LB平板的菌落通过孵育37℃24小时补充有34微克/毫升^-1卡那霉素^。20
2. 从A酪氨酸转氨酶（tyrB）的克隆拟南芥的功能互补。
   注:关于cDNA的从A克隆的完整细节拟南芥由At5g36160先前已描述的轨迹标记注解⁴
   1. 通过PCR扩增该cDNA。使用在94℃1个循环2分钟，随后为15秒的94℃30个循环，60℃30秒和72℃2分钟。包括引物各12皮摩尔，1毫_硫酸镁 ，四个脱氧核苷酸三磷酸，和DNA模板为0.5ng和Pfx DNA聚合酶的1个单位的0.5毫米。
      注意:用于CL的引物是At5g36160的oning如下:
      在 tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3'
      AttyrB R- 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3'
   2. 克隆该片段到质粒pET30a中消化用ECORI和SAL1 PCR片段以产生重组质粒pET30a中:: At5g36160;结扎在使用T4DNA连接酶如以下描述的片段到pET30a ⁴
   3. 为了创建功能互补质粒消化的pET30a :: At5g36160用限制酶XbaI和HindIII，以及使用同样的限制性酶位点，以产生使用T4DNA连接酶将重组质粒pBAD33 :: At5g3160结扎插入到pBAD33。
      1. 孵育插入件的50纳克并在1×连接酶缓冲液20纳克载体和1单位T4 DNA连接酶过夜17℃。变换连接入E.大肠杆菌 DH5α细胞和屏幕上的LB平板菌落补充34微克/毫升^-1氯仿溶剂通过孵育37℃24小时ramphenicol ⁴
3. 的克隆UDP- n在五 -acetylmuramoyl基-L-丙氨酰-D- glutamate- 消旋 -2,6-二氨基庚二酸连接酶（MURE）为棘功能互补。
   注:牟礼ORF从五克隆棘已如前所述^。18
   1. 通过PCR扩增开放阅读框。使用在94℃1个循环2分钟，随后为15秒的94℃30个循环，60℃30秒和72℃2分钟。包括引物各12皮摩尔，1毫_硫酸镁 ，四个脱氧核苷酸三磷酸为0.5mM，0.5纳克模板DNA和Pfx DNA聚合酶的1个单位。然后克隆到质粒pET100D以产生质粒pET100D :: VS MURE。
      注意:是用于VS MURE的克隆的引物如下:
      VS牟礼F- 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3'
      VS牟礼R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3'
   2. 为了生产用于功能互补的质粒，消化pET100D :: VS牟礼
      用限制酶XbaⅠ和SAL1和结扎插入到pBAD33，以产生重组质粒pBAD33 :: VS MURE使用T4DNA连接酶。
      1. 孵育插入件的50纳克和20毫微克在1×连接酶缓冲液载体，用1单位T4 DNA连接酶，过夜17℃下沿。变换连接入E.大肠杆菌 DH5α细胞和屏幕用于通过孵育37℃24小时补充有34微克/毫升^-1氯霉素在LB平板上的菌落^。8
4. 从Novosphingobium SP的功能互补RELA / 秒壶（RSH）的克隆。
   注意 :从Novosphingobium藻 RSH的克隆已如前所述^17。
   1. 放大RSH ORF除了599个核苷酸upst在起始位点和46个核苷酸通过PCR终止点下游的一分子。使用在94℃1个循环2分钟，随后为15秒的94℃30个循环，60℃30秒和72℃2分钟。包括引物各12皮摩尔，1毫_硫酸镁 ，四个脱氧核苷酸三磷酸为0.5mM，0.5纳克模板DNA和Taq DNA聚合酶的1个单位。然后克隆到质粒pCR2.1中，以产生的pCR2.1 :: NSP的rsh。
      1. 孵育1微升PCR扩增片段，1微升pCR2.1载体中的盐溶液1微升和1微升水。孵育在25℃下5分钟，2微升结扎到大肠杆菌的大肠杆菌细胞，并且屏幕上的LB平板的菌落通过孵育37补充有50微克/毫升卡那霉素^-1 °下放置24小时。
         注意:是用于RSH的克隆的引物如下:
         RSH F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3'
         RSH R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3'
      2. 为功能互补，消化质粒pCR2.1中:: NSP的rsh用ECORI和结扎插入到广泛宿主范围pRK290，以产生重组质粒pRK290 :: NSP RSH使用T4DNA连接酶。
         1. 孵育插入件的50纳克并在1×连接酶缓冲液20纳克载体和1单位T4 DNA连接酶过夜17℃。变换连接入E.大肠杆菌 DH5α细胞和屏幕上的LB平板的菌落通过孵育37补充有10微克/毫升^-1四环素 °下放置24小时^。17

2.准备电能力的细菌细胞来促进转型

注:电感受态细胞的制备是基于协议26为1.0L的培养物，可以按比例缩小到一个较小的体积（ 即，250毫升）。请注意，这个协议可以bË用来做主管，在这个手稿，以方便FCA中描述的所有菌株^。22

1. 接种入50ml液体培养基中具有单个菌落到烧瓶中并生长过夜，并确保在开始该步骤（ 表2）之前检查突变体的基因型。
2. 在第二天，接种1.0升的50过夜培养毫升合适的培养基（LB 大肠杆菌突变体与PD Novosphingobium SP），并生长至OD _{600〜0.4-0.6（}对数相），在30℃ C。
3. 收获细胞通过在4℃下以5000 xg离心离心15分钟，倒出上清液，并且重悬沉淀在500毫升无菌冰冷纯H ₂ O的
4. 离心将细胞以5,000 xg离心在4℃下20分钟，倒出上清液和重悬沉淀在250ml无菌冰冷的10％的甘油。
5. 离心细胞在5000 XG在4 20分钟 °C，倒出超游泳和重悬沉淀在2.0ml 10％甘油。
6. 通过转移50微升到微离心管分装细胞，并立即通过将管在干冰 - 乙醇浴冷冻。存储感受态细胞在-80℃下电。

3.互补质粒的细菌细胞电穿孔

1. 对于电穿孔，添加重组质粒的1.0微升（10-50纳克）到感受态细胞的等分试样（50微升），并在冰上放置5分钟。
2. 通过移液转移混合物至电穿孔杯中和电穿孔装置设置为以下设置:25μF电容，2.5千伏和200欧姆电阻，并提供一个脉冲。
3. ，增加1.0毫升回收介质（LB）的电穿孔杯中和转让的用移液管向15毫升锥形管中。在一个摇床轻柔旋转60分钟恢复。
4. 从RECO板100微升文化很跨上琼脂平板来选择吹打转化和使用无菌扩张蔓延。
   注:确保在开始这一步，检查抗生素和基因型进行正确琼脂平板前检查表1和表2。

4. AOH1的转型，以促进功能互补使用L，L-二氨基转氨酶（DAPL）

1. 用于互补分析，变换AOH1用空载体（pBAD33），并与使用在节3.0中概述的电协议独立的转化事件的DAPL的表达载体。
2. 通过电镀补充有50微克/毫升^-1磷酸二铵和34微克/毫升^-1氯霉素和50μg/ ml的卡那霉素^-1 LB琼脂培养基上选择转化体。
3. 划线到LB我测试通过副本镀殖民地功能互补dium用0.2％具有和不具有50μg/ ml的^-1磷酸二铵和34微克/毫升^-1卡那霉素（重量/体积）阿拉伯糖。
4. 在30℃孵育板24小时，观察结果。
   注意:结果应该表明，与载体仅控制时的突变是唯一能够在仅当DAPL基因在突变背景表示DAP可用媒体生长。

5.转化TKL-11的要求促进功能互补使用UDP-Ñ-acetylmuramoylalanyl-D-谷氨酰基-2,6- 消旋 -diaminopimelate连接酶（MURE）

1. 变换用空载体（pBAD33）并使用在节3.0中概述的协议的MURE表达载体（pBAD33 :: VsmurE）的突变体。
2. LB琼脂培养基上板，并选择转化体补充有50微克/毫升^-1胸腺嘧啶和34微克/毫升^-1氯霉素并在30℃下孵育板24小时。
3. 通过从对照和实验变换到两个LB培养基加上0.2％（重量/体积）阿拉伯糖和50微克/毫升^-1胸腺嘧啶条纹或电镀菌落试验互补。
4. 孵育在30℃下一个板，另一个在42℃下放置24小时，以目视评估的生长表型。
   注意:结果应该表明，该突变体是能够在42℃下生长，只有当MURE基因在突变背景表达相比，矢量仅控制。

6. DL39的转型，以促进功能互补利用酪氨酸转氨酶（tyrB）

1. 在LB琼脂平板变换DL39与任一pBAD33或pBAD33 :: At5g36160，并选择转化体补充有50微克/毫升^-1酪氨酸，50微克/毫升^-1苯丙氨酸，和使用协议34微克/毫升^-1氯霉素在部分所述3.0。
2. 复制品上最小（M9）媒体-plate菌落用50微克/毫升^-1苯丙氨酸和50微克/毫升^-1酪氨酸，50微克/毫升^-1天冬氨酸盐，50微克/毫升^-1亮氨酸，50微克/毫升^-1缬氨酸， 50微克/毫升^-1异亮氨酸，10微克/毫升^-1尿嘧啶0.5％（重量/体积）甘油，0.2％（重量/体积）阿拉伯糖。上划线两个板的相同的菌落缺乏苯丙氨酸和酪氨酸板也复制品板菌落。
3. 在30℃下孵育板48小时，观察生长表型。
   注意:结果应该表明，与载体仅控制时的突变是唯一能够在苯丙氨酸和酪氨酸的培养基生长，只有当tyrB基因表达的突变背景。

7.转化Hx699，方便Novosphingobium的Hypomucoid表型SP的功能互补。应变Hx699

1. 变换野生型菌株Novosphingobium 属 （Rr2-17）和突变Hx699与pRK290和pRK290 :: RSH _NSP使用在节3.0中概述的变换协议2个独立的转化事件。
2. 板在马铃薯葡萄糖的转化（PD）琼脂补充有10微克/毫升^-1四环素，孵育至少24小时或直到转化体出现。
3. 条纹两个变换中的新鲜的PD琼脂板上一个"X"图案，并且在30孵育 °℃至少4天。通过目视检查两个板的生长表型观察仅载体，和实验的表型。
   注意:结果应该表明，当RSH在突变背景中表达时相比，矢量仅控制所述防粘液表型补充。

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结果

了在各功能互补分析中使用的细菌菌株列于表2中 。

功能互补分析:L，L-二氨基庚二酸转氨酶（DAPL）

大肠大肠杆菌双突变AOH1（ΔDAPD :: Kan2，dapE6）窝藏在dapE的基因中的突变和DAPD基因的完全缺失（ 图1）。这样，突变体不能生长，除非提...

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讨论

许多是不可或缺的生物技术和分子生物学课程在罗切斯特技术学院的课程除了拥有课程的讲授实验室组件。学年2014-2015年的课程包含了共48场，其中29含有实验室组件，它代表了约60％。一个这样的课程是植物生物化学和病理学（FPBP），混合的讲座/实验课和生物分离的基本原理:原理与实践（BPP），以实验室为基础课程。

每门课程的实验室组件旨在加强讲课材料。例如，生化?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli mutants	Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporator	Biorad-USA	1652100
Electroporation Cuvettes	Biorad-USA	1652082
Temperature controlled incubator	Generic
Microcentrifuge	Generic
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Broth	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Potato Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platinum pfx DNA polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01