内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模

摘要

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

摘要

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

引言

转移占引起实体瘤死亡的90％以上。骨是受各种癌症类型，特别是乳腺癌和前列腺癌的转移中最常见的器官。当诊断在临床上，骨转移一般都已经进入高级阶段，在骨无论是溶骨性或成骨细胞的改变，常伴有神经症状。

以往的研究主要集中在明显溶骨骨转移^1-3，但是我们目前有溶骨过程来临前限制骨骼微的理解。这至少部分是由于缺乏合适的实验模型和方法。乳腺癌的基因工程小鼠模型常转移至肺部，但更高效地骨^4。同样，原位移植瘤很少自发的骨转移，一些骨热带4T1乳腺carcinom子的克隆和MSP过表达PyMT转基因小鼠模型例外^5-7。帧内胫钻孔可以提供癌细胞的骨^8-10，但它也导致损伤和炎症到局部组织。目前的乳腺癌细胞系心内注射已经调查骨定植^11-13的主要方法。然而，在癌症细胞导入左心室只有有限的比例将最终达到骨和骨髓，使得它难以跟踪在一个量化的方式微观转移。

在这项研究中，我们建立了一种技术，即帧内髂动脉（ⅡA）注射^14，癌细胞选择性地递送到后肢组织中，从而丰富癌细胞在骨和骨髓而不导致破坏局部组织。由于骨特异性，该方法还允许有足够的时间好逸恶劳癌细胞的一个前殖民最终imals屈从于原发肿瘤或转移的其他重要器官。当与各种其他技术，如生物发光成像，免疫荧光染色和骨形态计量学结合，ⅡA注射是相关的骨转移研究目的宽范围可能有用的，尤其是跟踪从单个癌细胞多小区进展微转移。特别是，我们表明，IIA族注射使我们能够可视化癌细胞和各种类型的在骨微环境周围细胞之间的相互作用。

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研究方案

所有的动物工作是按照药品的贝勒医学院的动物护理准则进行。

1.细胞的制备

注意:不同的癌细胞系可以用于IIA注射取决于研究目的。我们已经使用了乳腺癌细胞系MCF7，4T1，4T07，MDA-MB-361，MDA-MB-231，MDA-MB-436和前列腺癌细胞系C4-2在我们的研究。我们通常使用两种GFP-和萤火虫荧光素酶标记的肿瘤细胞对我们的研究，并从GFP荧光素酶标记的MCF7细胞系在这里显示的一些数据。

1. 保持在5％CO ₂含有10％FBS和0.1mg / ml的青霉素-链霉素，在37℃的细胞在DMEM中。
2. IIA注射前，trypsinize在80细胞 - 90％汇合，用0.25％胰蛋白酶/ EDTA溶液。用冷PBS洗细胞两次，并重新悬浮细胞在10ml PBS中的细胞计数。以除去PBS，离心细胞，在800×g离心5分钟。
3. 重新悬浮细胞在冰冷的PBS一个的5×10 ^6个细胞/ ml的浓度。
4. 用100微升GFP-和萤火虫荧光素酶标记的肿瘤细胞注射IIA一个鼠标的。
   注意:因此，每个动物接收的细胞数为5×10 ^5个该数目可能需要基于对细胞系的侵袭性被改变。
5. 置于冰上细胞悬液。
   可能需要的振动，以防止细胞聚集每隔几分钟，直到它准备好用于注射:音符。对于某些细胞系（如MDA-MB-231），可能需要更严格的程序（ 例如 ，通过45微米的细胞滤网），以防止聚集。请注意，血管的堵塞可导致组织坏死，并且因此混杂的实验。

2.动物的制备

1. 动物疼痛管理，得到5毫克/公斤/天卡洛芬（或其它止痛药）与膳食补充剂给小鼠手术前不小于24小时。管理剂量的手术前0.1毫克/毫升丁丙诺啡皮下注射60分钟。注意:任选的步骤是植入雌二醇托盘到动物的背部，以提供额外的雌二醇。这将加速ER +肿瘤细胞的增长（ 如 MCF-7细胞^）9。
2. 麻醉4 - 第6周龄小鼠（约20克）用氯胺酮（80 - 100毫克/千克）和赛拉嗪（10 -12.5毫克/毫升）腹腔注射。
3. 通过确认脚趾捏20 G鼠标和呼吸频率减少50％的观察镇静的适当水平和粉红色粘膜（如鼠耳皮肤和皮肤爪子）。保持手术过程中监测这些生命体征，每15分钟。注:动物的无动作表明，该动物是充分麻醉，准备手术。
4. 使用于眼部兽医药膏，以防止干燥。
5. 剃须鼠标放在下腹部，尤其是右腹股沟区域，手术和注射会发生。
   注意:如果使用无胸腺裸鼠这是没有必要的。
6. 把鼠标在它的后面，传播腿在它们的自然位置，坚持脚趾用胶带剥离移动纸板。
7. 请用70％乙醇异丙醇浸泡消毒棉签右腹股沟区，随后与优碘手术擦洗几次。

3.髂总静脉和动脉位置，并分离

1. 使1.0皮肤切口- 1.2厘米长的第4 ^次 ，并使用在3号手柄保持无菌，＃10碳钢手术刀片5 ^个乳头在右下腹部之间。然后用无菌手术盖布来覆盖动物体除外切口部位。
2. 移动动物标准台式解剖显微镜。使用4X的放大率注射。
3. 根据解剖显微镜的放大4倍，将脂肪组织和peritoneu之间钝性分离钳m和向外推两侧组织以暴露髂血管和神经（参见图1）。
   注意:从中线主动脉和动脉分支的下部之间的动脉被称为髂总动脉。这是其中注入发生。
4. 使用一对直线细镊子通过血管和神经之间的结缔组织（如膜）打破，接近船只。
5. 切换直细镊子左手。抓住一对用右手角度的细镊子的。将右手镊子到同一位置，结缔组织已经被打破。然后通过粘右手镊子，容器的下方。
6. 同时，插入左手镊子插入血管的左侧的结缔组织，以指导右手镊子经历。
7. 一旦右手镊子得到船底下，试图将船从周围的TI分开ssue多一点点，然后让他们在右手镊子的顶部。
8. 使用左手钳提供一个4-0丝线缝合的尖端右手镊子，然后通过血管下方轻柔缓慢地拉出缝合。注:现在无论是常见的静脉和动脉血管被缝合举起来（ 见图2）。

4.注射后注射护理

1. 准备用于注射的细胞在31克胰岛素注射器。使用100μl的细胞悬浮液在PBS中每次注射。确保吸取上下数次以分离细胞并避免聚合，使得注射的细胞不会堵塞和阻塞血液流动。
2. 与在左手倾斜钳，把钳子沿着缝线的引导容器的下方，然后打开钳子的两个臂，具有对镊子轻轻保持的血管。
   注意:钳子的两个臂之间的间隔将是第injection网站。
3. 持用100μl细胞悬浮液的31克针在右侧，与针的斜面向上，准备用于注射。
4. 针插入动脉管腔（血液会进入针头）。然后推细胞悬浮液缓慢地注入细胞。将细胞悬浮液将推开红细胞中的容器中。尽量不要打破船只或泄漏细胞悬液出来。
5. 当注射完毕后，轻轻地拉了回来针，并继续保持船只在左边手钳止血。话扯远了缝合。
6. 拉开左手钳，赶紧用棉签按压切开动脉区止血。
   注意:通常5 - 10分钟的持续压力足以止血。
7. 当出血停止，用皮胶，关闭手术区域的皮肤边缘。使耳标签，并检查生物发光信号来检查注射的细胞的分布。
   注:一个成功的注入将导致类似的图像中图3。
   1. 以100微升15毫克/毫升的荧光素在PBS注射75毫克/经由帧内眶窦千克小鼠浓度检查的生物发光信号。
      1. 对于帧内入轨，把鼠标两侧眼球的手指，使用压力，使眼球从眼睛框稍微弹出，插入眼球和鼻子之间的28克胰岛素注射器针头，然后慢慢推注射器注入荧光素。
         注意:在正确的位置，针应能达到2的深度 - 打硬组织（骨）前3毫米。
      2. 鼠标放置到成像系统用于体内整个动物成像10 - 5分钟内60秒（ 见图3）。
         注意:可选的步骤是植入雌二醇粒料到动物的背部，以提供额外的雌二醇。这将加速ER +肿瘤细胞的生长（ 例如 ，MCF-7细胞^）15。
8. 离开鼠标放在一个温暖的加热垫，直到醒来。监控出血，肿胀，在手术后的一段开裂和疼痛的迹象。把老鼠回用镇痛药覆盖率（carprofin膳食补充剂的建议）疼痛管理给定的，直到没有痛苦的迹象笼。在手术后7天密切关注和照顾动物。

5.监测转移性生长

1. 组织形态测定:
   1. 收获肿瘤携带骨组织，固定在4％低聚甲醛的骨头24小时，然后脱钙它们在pH 7.0的3 14％的EDTA溶液-第5天，并使其受到石蜡包埋如前所述^14。
   2. 部以3微米的厚度的石蜡嵌入骨组织和如先前所述¹⁴进行苏木精/曙红染色的标准的组织学方法。
2. Immunohistochemis尝试:
   1. 受试者石蜡包埋的肿瘤轴承骨滑动如前所述¹⁴免疫组织化学染色用于各种目的。简言之，将免疫染色的MCF7肿瘤细胞通过抗GFP抗体，和免疫染色的成骨细胞（预成骨细胞和成骨细胞）分别由抗Osterix的抗体和抗碱性磷酸酶（ALP）的抗体。

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结果

图1示出的解剖位置和髂总动脉（红色）和静脉（蓝色）的关系。

图2显示了在解剖镜下髂血管和神经的相对位置。 如图2A所示，血管和神经的右腹膜壁下方和皮肤切口由与腹膜推开后，可以发现。髂总静脉是在左侧，并与动脉是更大和更暗。动脉是在中间，并期待粉红色。它比静脉薄，?...

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讨论

虽然只有髂动脉被注射癌细胞的目标，我们建议既髂静脉和动脉从周围组织中分离，并把它们一起抬起作为包。这是因为静脉和动脉广泛相互接触，与静脉血管壁薄，容易断裂。因此，对于一个成功的注射，这样可以节省时间和精力，将两个容器保持在一起，虽然癌细胞仅注射到动脉。 4-0丝线来帮助这个过程如图2所示，缝合线还可以帮助它应该出现止血。

需要?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45 μM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Avoid eye dryness
Shaver	Oster	78005-050	For furred mice
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Multiple
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Need to be autoclaved
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Need to be autoclaved
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Need to be autoclaved
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G insuline syringes	BD	328418	Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	For surgery site skin closure
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Avoid light and put on ice
28 G insulin syringes	BD	329410	For intra-orbital injection
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation
EDTA	OmniPur	4050	For bone tissue decalficication
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552