一种酶和无血清神经干细胞培养模型EMT研究适合药物发现

摘要

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

摘要

上皮至间质转变（EMT）描述的上皮转分化成间充质的过程。 EMT是也通常发生在胶质母细胞瘤，最常见的恶性脑肿瘤胚胎发育过程中的基本处理。 EMT也已在脑外多种癌包括乳腺癌，肺癌，结肠癌，胃癌观察。 EMT是通过促进迁移，侵袭和转移形成集中挂恶性肿瘤。 EMT诱导的机制尚未完全清楚。在这里，我们描述了皮层神经干细胞（NSCs）和随后的EMT诱导的标准化隔离的体外系统。这个系统提供了以使用单细胞或外植体培养的灵活性。在这个系统中，大鼠或小鼠胚胎前脑的神经干细胞是在限定的培养基中培养，不含血清和酶。的神经干细胞表达Olig2的和SOX10两个转录因子在oligodendroc观察YTE前体细胞（OPCs的）。使用这个系统，FGF-，BMP-和之间的相互作用的TGFβ信号传导涉及ZEB1，ZEB2，观察TWIST2哪里的TGFβ-活化显著增强细胞迁移，这表明有协同BMP-/TGFβ-相互作用。结果指向FGF-，BMP-和TGFβ-信令网络，以参与EMT诱导和维持。这个模型系统相关的体外研究EMT。它是具有成本效益的和显示出高再现性。它也允许对不同的化合物相对于它们的迁移响应（定量距离测量），和化合物抑制或增强EMT（定性测定）的高通量筛选的比较。因此，该模型是非常适合于测试药物库影响EMT物质。

引言

在胚胎发育的几个阶段，上皮细胞失去强粘附到彼此（ 例如，紧密连接），并获得在这个过程被称为上皮至间质转变^（EMT）1迁徙表型。 EMT需要形成额外的细胞类型，如间充质神经嵴细胞，一个人口从神经上皮²偏析。 EMT是不在胚胎阶段只有必要的，但还需要在成年生命的后期阶段保持在成年生物体的生理过程，如伤口愈合³和中枢神经系统（CNS）的再生在脱髓鞘病灶^4。

上皮性肿瘤是众所周知的激活EMT作为迁移，侵袭和转移引发步骤，最终导致癌症的发展^1,3。 EMT确实集中连接到强大的迁移^1,3。 C的细胞的步骤onditioning，发起，接受和维持EMT尚不完全清楚，需要进一步调查。

在此，提出了一种基于神经干细胞的标准化体外 EMT模型系统，以确定生长因子和媒体（无血清和无酶的使用）。这个模型系统是在EMT工作的科学家的相关性。蜗牛，瑞伯和Twist蛋白家族已被证明是既在发育和疾病¹为EMT的关键。蜗牛，瑞伯和扭曲的家庭也参与所提出的系统。该系统是基于通常不经历EMT提供一个特别的优点为初始事件的EMT诱导时研究的前脑的特定区域。

该模型系统可能被用于研究在CNS外上皮EMT，由于关键的EMT诱导剂，如蜗牛，瑞伯和扭曲的蛋白质，也都EMT期间在CNS外组织系统中发现的。该型号System使神经干细胞的分离标准化来自发展中国家皮质学习一般干细胞的功能和EMT尤其如此。使用该系统，我们分离的神经干细胞，诱导的EMT和研究FGF2和BMP4的作用下随后的迁移。我们观察到，FGF-和BMP-信令相互作用与TGFβ-信令以促进细胞迁移，从而验证该模型的系统。

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研究方案

所有动物的程序遵循指南"实验动物的护理和使用"（NIH出版， ^第 8版，2011）和巴塞尔的动物福利委员会（用于动物的护理和使用瑞士准则）获得批准。通过这些准则的动物协议被认为是"最严重的动物品位"的。

1.膨胀培养基的制备

注:在无菌条件下的标准组织培养工作。

1. 取两个15毫升管，加入5 ml L-谷氨酰胺的DMEM / F12（1:1）从500毫升培养基瓶到每个两个15毫升管中。到的前15毫升管中，添加50毫克人脱辅基转铁蛋白，腐胺1M的股票（0.1毫终浓度）的50微升和硒酸钠500μM的股票（最终浓度为30nM）的30微升。
   1. 通过0.2μm注射器过滤成原来的DMEM / F12瓶过滤。
2. 到第二15ml试管中，添加12.5毫克胰岛素。加6 - 9滴1M的氢氧化钠。涡旋以完全溶解的胰岛素。通过0.2μm注射器过滤成原来的DMEM / F12瓶过滤。
   注意:氢氧化钠是有毒和腐蚀性。使用防护手套，外套，和护目镜。
3. 5毫升青霉素（10,000单位/ ml）/链霉素（10,000微克/毫升）/两性霉素B（25微克/毫升）添加到DMEM / F12培养基瓶。
4. 加入5毫升的200mM L-谷氨酰胺股票刚解冻或寡肽含有谷氨酰胺（200mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）的DMEM / F12培养基瓶。
5. 摇匀。准备50毫升等分。
   注意:膨胀介质可以在4℃贮存至少2周。相比保持在500毫升的瓶子分装中显示管少pH值的变化。

2.传代培养基的制备

1. 以1升的Ca ²⁺ -和Mg ^{2 2+} HBSS媒体，添加990.85毫克葡萄糖（5毫摩终浓度）和840.10毫克_碳酸氢钠 （10毫米终浓度）。调节pH至7.3，用HCl（1M的股票）。过滤消毒用0.2微米的过滤器和赢利50毫升分装。
   注意:传代培养基可在4℃贮存至少4周。

3.生长因子的制备

1. 制备无菌1×PBS中的1％BSA（PBS-BSA）的单独或与在4mM的PBS（PBS-BSA-HCl）的盐酸（HCl）。
   注意:盐酸是腐蚀性和毒性，需要特殊的安全措施（大衣，护目镜，手套，头罩）。
2. 解散10微克/毫升重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）在PBS-BSA（10毫微克/毫升终浓度），10微克/毫升的重组人骨形态发生蛋白4（rhBMP4）在PBS-BSA（10毫微克/毫升的最终浓度），和20μg/ ml重组人转化生长因子β1（rhTGFβ1）在PBS-BSA的盐酸（40纳克/毫升最终浓度）。
   1. 不要过滤消毒。准备等分。
      注:生长因子等份可以储存在-20℃，至少2年。

4.涂料细胞培养皿中

1. 溶解1,875毫克的聚L-鸟氨酸在500毫升（巴解组织）蒸馏水₂ O准备了250X巴解组织的股票。过滤消毒用0.2μm注射器过滤器和将2毫升分装。
   注意:这些等分试样可被储存在-20℃下至少2年。
2. 溶解1毫克牛纤维粘连蛋白在1毫升无菌蒸馏水₂ O准备纤维连接蛋白1000倍的股票。不要涡旋因为这可能会凝结成块的黏蛋白。轻轻摇动用手10分钟。
   1. 孵育在室温下偶尔摇动1小时。检查完全溶解。温热该溶液至低于37℃，纤连蛋白的完全溶解。不要过滤，消毒。
      注意:溶液可以被存储在4℃下长达6个月。
3. 如需要使用的等离子预处理塑料细胞培养皿（100毫米或其它尺寸本实验）。为了评估迁移，使用35毫米菜肴500微米的网格。过夜用2ml 1X PLO在37℃下在5％CO ₂的组织培养箱中孵育菜肴12小时。用2ml 1×PBS中洗两次。
4. 在37℃下加入2毫升1×纤连蛋白（1微克/毫升终浓度）孵育菜肴最少12小时的，在5％CO ₂的培养箱中。刚电镀细胞之前删除纤维连接蛋白。
   注意:纤连蛋白包被的培养皿可以在37℃下贮存至少2周。

5.标准化的解剖和皮质下区的准备（SVZ）

1. 获得大鼠胚胎14.5天（E14.5，只SD）和小鼠E13.5（C57BL / 6）通过胚胎定时交配。交配18:00动物，直到第二天早上08:00。交配后的一天中午被认为是E0.5。
2. 麻醉孕动物，用5％异氟醚和0.8升/分钟的氧气流。通过检查用锋利的爪子迪斯响应压缩挠度镊子。斩首动物。避免_二氧化碳窒息的CO ₂会影响干细胞的恢复。
3. 检索剖腹产胚胎。
   1. 将动物仰卧位和消毒用70％乙醇的皮毛。使用外科镊子和剪刀使约8cm V形皮肤切口在子宫上方的下腹部。切开只有皮毛，同时保持肌肉的墙壁完好无损。
   2. 使用新鲜镊子和剪刀切开肌肉和腹部肌肉壁进入腹膜。
   3. 识别在下部后腹膜子宫。从周围组织被删除锐性分离子宫。
   4. 洗用无菌1×PBS中的胚胎并置于冰冷的1×PBS中的子宫。
   5. 用细尖的剪刀剪开子宫壁由胚胎解剖显微镜下释放胚胎（放大3倍， 图1B）。用一对镊子除去胚胎船体（ 图1B）。保持冰在扩张中的胚胎。
   6. 由显影大鼠神经系统⁵的图谱验证正确的发育阶段。正确的胚胎尺寸示于图1B。
   7. 通过如在图1A中所示的鼠前肢（佛罗里达州）的开头位形成的存在下进一步检查正确的年龄。
      注意:后肢（HL）尚未显示数字的分离（ 图1B）。
4. 对于剥离，转移胚胎充满了冰冷的1X PBS无涂层的培养皿。使用高压细镊子立体解剖显微镜（3X到20X倍）下进行清扫。
   注意:培养皿中防止组织与餐具表面的附着，与等离子涂层细胞培养皿可能发生。削尖的钨丝，针或类似也是夹层的某些步骤有帮助。
5. 取出头部皮肤及颅骨开始在INTE通过以获得显影神经管（ 图1C）前方和后方的两个镊子同时拉动显影端脑（TEL）和间脑（DI）（ 图1B）的rsection。
6. 确定中脑-后脑边界（MHB，黑色箭头图1B-D），分离从菱脑的中脑（MES）。切菱脑只是在或低于MHB（ 图1D，三角形箭头）。
   注:在MHB额外的皮下空间有利于去除皮肤，而不伤害神经管。
7. 在断绝颅底与面部骨骼（ 图1E）端脑/间脑之间的连接。这导致含端脑，间脑和中脑（TEL-DI-MES）（ 图1F-H）的块。
8. 传送TEL-DI-MES块进入膨胀介质在冰上。保持完满成功伊利浑身膨胀介质在未涂布培养皿。握住块在一双镊子的脑，以免触及包含与神经干细胞皮质SVZ端脑。
9. 重复步骤5.5至5.8的所有的胚胎（ 图1F-H）。
10. 转移一个TEL-DI-MES块到新鲜的冰冷的1X PBS。沿于前脑（ 图1F-H）中的虚线切割，从间脑分离脑， 如图1I。
11. 通过沿图1F中的虚线切割从TEL分开的DI。参见图1J隔离端脑。
12. 拆分两个端脑半球，沿着图1J的虚线切割。这导致两个分离的半球， 如图1K所示。
    注:左半球如图1L放大。
13. 确定内侧团伙lionic隆起（MGE， 图2A; *）和横向神经节隆起（LGE， 图2A +）通过椎间孔未来可见interventriculare。
    1. 使用镊子或针，沿着在MGE和LGE和前皮层（蚂蚁-CTX， 图2B）之间的交叉点的直线解剖。通过皮质，海马（臀部）和脉络丛（CP）的切割直线。这个分离前皮层包括来自神经节隆起嗅球（OB）（GE， 图2B，C）。
14. 在尾神经节隆起（CGE， 图2C，D）和后皮层（ 图2C）的交叉点切的第二直线，通过皮层，海马和脉络丛再次切割。
15. 扁平化端脑。完全除去后极和嗅球（ 图2D）。鉴定含有海马和脉络丛（ 图2C）皮质下摆，如先前^6,7限定。
    注意:海马具有比皮质较薄神经上皮。该CP含红船。
    1. 从皮层分离皮质下摆，而使皮质相同于神经节隆起（ 图2D）的大小的大小。这导致皮质（靶组织）和神经节隆起（GE， 图2D）的块。
16. 翻转与心室（内）侧与餐具表面皮层-GE块。
    注意:半球的外表面将面对实验者（ 图2E）。上的外表面是血液的容器中，脑膜（ 图2E）。
    1. 针脚的GE用左手盘表面，并与在右侧（显性）手用镊子剥离脑膜关闭（ 图2F ）。
       注:这是技术上最苛刻的步骤，因为脑膜强烈坚持皮质。从皮层脑膜的分离是通过切割在步骤5.13.1和5.14完全直线（未锯齿状）促进。
17. 重复步骤5.12到5.16的另一半球，所有的胚胎。切割沿LGE皮层在LGE（ 图2G，2H）一半的主直径的距离。解剖皮质跨越1.2毫米x 2.4英寸毫米（ 图2H）的面积，包括与神经干细胞在SVZ /生发层。

6.准备外植体培养的

1. 切皮质成直径小于400微米（ 图2I）的外植体。使用定位在解剖培养皿下列参考（ 图2H和2I）400μm的格子（ 补充图1）。全部转让植到一个新的培养皿冰协LD膨胀介质。
2. 从组织培养皿（步骤4.4）拆下纤维连接蛋白。允许它干。 1毫升冷膨胀介质的添加到35mm培养皿以10毫米×10毫米（ 图3）的网格尺寸的中心。允许介质中以形成一个球形下降（ 图3）。
3. 插入多达8个外植体以液滴的中心。外植体应坐落于电网与迁移分析相互之间至少有3毫米的距离（见第8节）。
4. 孵化菜用于在细胞培养孵化器外植体的附着约1小时（37℃，21％O _2，5％的CO _2）。允许外植体沉降并附着在纤连蛋白涂覆的表面。不要摇晃的菜，因为植体分离和移动优化电网中心的。
5. 孵育1小时后（37℃，21％O _2，5％的CO _2），该盘填满至2ml膨胀介质的总体积加生长˚F行动者或感兴趣的物质的测试和孵化。
   注意:无论是酶消化，也不是血清或离心所必需的外植体的准备。这是最佳的细胞完整性。

7.准备NSC单细胞培养

1. 预热在37℃扩张和传代网上平台。
2. 传送解剖皮质片（从步骤5.17）放入15毫升管与冷膨胀介质（管A）。离心机皮质片5分钟，在1200×g的。吸出上清液。加入200μl预热的膨胀介质悬浮皮质件。
3. 加入700μl预热的传代中至15毫升管与P1,000头（管A）。轻轻重悬沉淀。将吸头在15ml试管的底部。通过与P1,000尖端抽吸三次轻缓地解离组织片。
   注意:传代培养基促进细胞分离，并且需要避免使用酶。
4. 允许管坐30到60秒，大（重）未解离片底部定居。单离解的细胞将保留在上清液中。转约700微升的上清液至新鲜15ml试管（试管B）。
5. 重复步骤7.3和7.4以解离大块。
6. 重复步骤7.3和7.4的第二时间以解离较大的碎片。全部转移到上清新鲜15ml试管（管B）。
7. 膨胀介质添加到5毫升的总体积。算使用血球细胞。通过台盼蓝染色评估死细胞。
   注:小神经干细胞容忍的步骤7.2至7.6比大细胞更好。从10胚胎期望约4×10 ^6个细胞，用10％的死细胞。
8. 为神经干细胞的扩张，板在8ml膨胀介质的体积每10cm纤连蛋白包被的组织培养皿1.5×10 ^6个细胞。对于标准的扩展，加入8微升的1000倍rhFGF2股票。添加8微升rhFGF2每天改变我直径隔日1次。
   注:在这个发展阶段的皮层中含有大多数的神经干细胞，只有分化细胞​​的少数。分化的少数细胞不给rhFGF2处理响应，并扩大培养过程中死亡。
9. 通路扩大的神经干细胞在60％汇合。
   1. 要通过神经干细胞，取出扩张中。洗涤细胞迅速三次用5毫升传代网上平台。等待2 - 4分钟。不含Ca ²⁺和Mg ²⁺的细胞从表面慢慢脱落，向上舍入。验证阶段显微镜下的细胞脱离。再等几分钟，如果需要的话，直到表面视觉支队观察。
      注意:单细胞就会完全分离，但多数仍细胞将坚持与餐具表面。需要分离的持续时间依赖于纤连蛋白涂层的持续时间。短纤维连接蛋白涂层（12小时或更少）导致更快的细胞脱落。对于较长的实验（>; 1周）超过24小时的纤连蛋白涂层建议。
10. 用10毫升吸管轻轻从表面分离细胞。收集与细胞中的5毫升传代培养基，并将其转移到新鲜的15ml试管。有一个额外的5毫升传代中的重复。
11. 离解在15ml试管中的细胞通过上下吹打三次，将10毫升吸管在管的底部。旋管15分钟，在室温下1200 xg离心。除去上清，悬浮于2ml膨胀介质中的颗粒。算使用血球细胞。使用台盼蓝评估死细胞。
    注意:扩张至60％汇合后，期望4 - 5×10 ^6个细胞与死细胞计数在10％左右。
12. 板每10cm培养皿进一步通路8×10 ^5个细胞。

8.迁移评估

1. 对于迁移评估，根据第5种子植于植隔离35毫米电网菜肴。电镀后一小时，添加FGF2（rhFGF2）。将在37℃培养箱菜2天。
   注:为了获得最佳的外植体附着，避免移动的菜肴。
2. 由1000微升提示删除网上平台。由1000微升尖端起始于内圆（ 图3），加入2mL扩张介质。这降低了外植体的表面张力。
3. 添加生长因子单独或根据需要组合进行实验。使用FGF2 / BMP4 /TGFβ1作为阳性对照。注意:在这个实验中，每35mm培养皿2微升FGF2，2微升BMP4和4微升TGFβ1分别单独和组合（ 图5）中加入。
   1. 添加额外的因子和/或测试的物质。保留菜在37°C 2天后再次触及。
4. 采取上倒置显微镜外植体的照片。
   注:生活外植体产生更好的相衬图像比固定细胞。两者都可以使用。
5. 对于迁移评估，使用图形软件，使像素测量（ 如 ，斐济^8）。
6. 测量为500μm距离像素的菜格，并用它作为内部参考。
7. 定义为外植体迁移起点的中心。测量外植体的中心和10个细胞的最外组之间的距离。
   注:所有细胞迁移从植离心之遥。它们自发形成于下测试的情况下（ 图5）的周围的片。

9.评估入侵

1. 根据协议第4制备纤连蛋白包被的组织培养的24孔板中。
2. 将300微升温暖扩展介质进入细胞侵袭室顶好。孵育室在37℃，30分钟和5％ _的 CO _2。
3. 除去从顶部以及膨胀介质和Boyden小室放置到涂覆24孔板。
4. 添加500微升与rhFGF2 0.5和0.5μlrhBMP4至底部以及温暖膨胀介质的。
5. 神经干细胞传代和第7节经文说明1至4计数都适合。
6. 板5×10 ⁵细胞以300μl暖膨胀介质与rhFGF2 0.3微升并在boyden小室的顶部以及0.3微升rhBMP4的体积。
7. 培养24小时的神经干细胞种子。
8. 添加额外的因子和/或检验的物质的腔室和培养的细胞另外48小时。
   注意:如果细胞是侵入性的，它们将通过从顶部以及通过基底膜层的底部很好。侵入细胞会附着到Boyden小室的底部。
9. 遵循由生产商提供的方案。用棉签（包含在侵袭测定试剂盒）通过清洗两次以除去在顶部以及非侵入性的细胞。
10. 从孔中除去培养基并加入500μl膨胀介质与质膜染色活细胞，用核染料DAPI到孔中。
11. 孵育在37℃下10分钟和5％ _的 CO _2。
    注意:染料将分别纳入膜和侵入细胞的细胞核，以获得最佳的可视化^8。选项​​:省略质膜染料如果多色免疫计划。
12. 与染料取出培养基并用扩张中洗两次澡。可视化和先前⁸演示了一个倒置荧光显微镜计数侵袭细胞。
    注意:某些侵袭性细胞可能已经从腔室的底部分离的，并已下降到低于它们粘到涂布表面，其中所述孔的表面。有关完整的分析，包括孔表面的细胞。
13. 除去培养基并固定在冰 - 冷的新鲜的4％PFA的细胞10分钟。洗3次用1×PBS。上侵袭细胞进行免疫细胞化学，如前所述^8-10。

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结果

此EMT模型系统是基于对NSCs都为单细胞或作为从显影神经管的特定区域的外植体的标准化的隔离，中央皮质（ 图1和2）。对于量化考核，在植500微米格培养皿中（ 图3）的中心接种的权利。从中央皮质植体首先暴露于FGF2两天，随后在生长因子（ 表1）的不同组合的其他两天。我们开始与它比显影神经管的其它区域更大的皮?...

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讨论

在这项研究中描述了EMT的分析利用神经干细胞的标准化系统（总结于补充图3）。标准化保证再现性（ 表1和2）。的神经干细胞被从显影皮质衍生的，通常不经历EMT的组织。这是有利的为在EMT早期步骤的分析。在EMT初始步骤不能充分研究中已积累的遗传改变，并且可以已经通过EMT的特征的肿瘤细胞。此外，原发肿瘤的样品是不理想的理解EMT因为大多数恶性肿瘤是异质含有?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BMP4, rhBMP4	RnD Systems	314-BP-01M
Bovine pancreas insulin	Sigma	I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay	Cell Biolabs	CBA-110	24 well plate system
Cell culture dish with grid	Ibidi 500 mm dish, 35 mm	80156
CellMask Orange	Life Technologies	C10045	Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI	LifeTechnologies	D1306	Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle	Gibco Invitrogen	21331-020
FGF2, rhFGF2	RnD Systems	233-FB-01M
Fibronectine, bovine	Sigma	F4759
Glutamax supplement	Gibco Invitrogen	35050-061
Graphics software with pixel measurement feature	Fiji	fiji.sc/Fiji	version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media	Sigma	H9394
Human apo-Transferrin	Sigma	T1147	Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine	Gibco Invitrogen	25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody	Genetex	GTX26142	Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody	Provided by Hirohide Takebayash	Personal stock	Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone	Gibco Invitrogen	15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody	Acris	DM3614P	Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine	Sigma	P3655
Putrescine	Sigma	P5780	Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite	Sigma	S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody	Millipore Chemicon	AB5774	Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1	RnD Systems	240-B-010
Uncoated Petri dishes	Falcon Corning	351029