急性心肌梗死的猪模型主要成果评估

摘要

可靠和准确的结果评价是临床前的疗法转化为临床治疗的关键。目前的论文描述了如何评估猪急性心肌梗死模型的心脏功能和损坏3临床相关的主要成果参数。

摘要

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

引言

减少射血分数（HFREF）心脏衰竭占所有心脏衰竭病例的50％，估计影响1 -人的2％，在西方世界^1。其最常见的病因是急性心肌梗死（AMI）。由于AMI后急性死亡率，由于认识的提高和改进的治疗方案显著下降，重点已经转向了慢性后遗症;其中最突出的HFREF ^2,3。连同增加的医疗费用^4，心脏衰竭的日益流行强调需要新颖的诊断和治疗方法，它可以在不利的重构的高度平移猪模型如前所述⁵进行研究AMI后。

不利的重塑两者，决定因素（ 例如，梗死大小）和功能评估（ 例如 ，超声心动图）经常用于新疗法功效测试，指示相对的需要iable和相对便宜的方法。目前本文的目的是通过引入重要和可靠结果的措施为在急性心肌梗死的猪模型中的功效的测试，以满足这一需要。这些措施包括在风险（AAR），3D食管超声心动图（3D-TEE）和详细的基于准入压量（PV）循环收购涉及面积心肌梗死面积（IS）。

梗塞面积是不利的重塑和生存的AMI后⁶的主要决定因素。尽管缺血心肌可能挽救可逆损伤的心肌细胞，并限制梗塞尺寸的及时再灌注，灌注本身导致通过氧化应力的产生和不成比例的炎症反应的其他损害（缺血再灌注损伤^{（IRI））7。}因此，IRI已被鉴定为有希望的治疗靶标。新的治疗的减小梗塞尺寸的能力是通过相对于评估梗死大小量化在风险（AAR）的区域。 AAR量化是强制性的，以校正在动物模型中的冠状动脉解剖的个体间变异性，作为较大AAR导致较大的绝对梗塞大小。因为梗塞大小，直接关系到心脏功能和心肌收缩力，在AAR变化可以影响无关研究治疗方式⁸的结果的措施。

三维食管超声心动图（3D-TEE）是测量心脏功能非侵入性安全，可靠，最重要的是，在临床应用廉价的方法。而经胸超声心动图（TTE）的图像不限于猪⁹ 2D胸骨旁长期和短轴视图，3D-TEE可以用来获得左心室的完整的三维图像。因此，它不需要左心室（LV）卷的数学近似，如修改后的辛普森的第¹⁰条。后者达不到科尔的ectly估计左室重构后左室容积由于缺乏圆柱形几何^11。此外，3D-TEE超过心外膜超声优选，因为它不要求手术干预，其中已经观察到施加在本模型¹²的心脏保护作用。虽然对于心肌功能的评估使用2D-TEE的已^13,14之前进行了说明，关于心室几何限制是类似于在2D-TTE观察取决于LV重塑的程度。因此，较大的梗塞（因而心脏衰竭的可能性越高），越容易二维测量成为由不正确的几何假设有缺陷和需要3D技术越高。

尽管如此，大多数成像方式在他们的评估心肌的固有功能特性的能力的限制。环光伏提供此类相关的其他信息，因此他们的收购在下面详细描述。

研究方案

所有的动物实验是由伦理委员会对大学医学中心的乌得勒支动物实验（荷兰乌得勒支）批准，并符合"指南照料和使用实验动物的"。

注:协议来执行闭胸气囊遮挡不是当前手稿的一部分，并在别处详细⁵进行说明。总之，猪（60 - 70公斤）进行左前降支（LAD）的中央部的75分钟腔内球囊闭塞。

既，三维食管超声心动图（3D-TEE）和压力 - 体积（PV）循环测量可以在基线，短期和长期随访进行。注意，这些测量被认为是在心肌梗死后的第一个小时内不可靠，由于在此阶段频繁心律失常。心肌梗死面积（IS）和面积有风险（AAR）测量preferablŸ评估在短期随访（24 - 72小时^）15,16，由于微血管和二级心肌疤痕变薄变化不太可靠的结果告终。梗塞大小染色是使用2,3,5-氯化三苯基四唑（TTC）（注意，刺激物），这被认为是高度可再现的和相对廉价的进行。 TTC是毫无色彩溶解在盐水中的白色粉末。在与各种脱氢酶接触，它被转换为一个砖红色。由此，判别活（红）和死心肌组织（白色）之间。有关这两种侵入性和非侵入性梗塞面积确定的概述，读者可以直接进行全面审查关于这个问题的^17。

图1示出的时间线包括麻醉，手术准备和在该研究中使用的主要成果的测量。

1.药物和麻醉

1. 确保动物不吃或喝之前的过程至少5小时。前处理，麻醉和手术后疼痛的治疗方案已在别处详细⁵进行了描述。
2. 总之，手术前一天的一buprenorfine补丁（5微克/小时）被施加到处于活动七天，以限制手术后疼痛的皮肤。在手术当天，稳重猪由0.4毫克/千克咪达唑仑，10毫克/千克氯胺酮和0.014毫克/千克阿托品肌肉注射。等待约10 - 15分钟。在耳脉之一插入18G的套管和管理5毫克/公斤钠硫喷妥钠诱导麻醉。
3. 插管使用气管插管（为60头猪大小8.5 - 70公斤）猪。如果需要的话，则执行气球通气（频率12 /分钟）和运输猪到手术室。
4. 一旦在操作到达战区，开始机械正压通气与氧合指数₂ 0.50 10毫升/公斤潮气量和使用连续的一个12 / min的频率二氧化碳监测记录。
5. 通过咪达唑仑的组合（0.5毫克/千克/小时），舒芬太尼（2.5微克/千克/小时）和泮库溴铵（0.1毫克/千克/小时）的连续静脉输注开始平衡麻醉。
6. 通过测试角膜反射及监测呼吸模式确认麻醉（ 例如 ，机械通气相结合的自主呼吸表明不完全麻醉）。使用对眼睛兽医药膏，以防止干燥而动物处于麻醉状态。

2. 3D食管超声心动图（TEE）

1. 要允许心脏速率监控和数据采集，连接动物到5带领超声心动图检查机器上的心电图。
2. 放置在右侧卧位的动物。确保探针是通过解锁操作件的直链和柔性的小费。
3. 打开猪的嘴，小心地插入食管回声探测。如果有必要，使用visua喉镜补肾中药。要小心，以避免在正常解剖咽囊结束了，类似于食管憩室^18。
4. 将50探头 - （从吻端尖测量）60厘米。缓慢旋转的探针和头部弯曲到左外侧位置形象化心脏（ 图2A - B）。确保所有的墙都清晰可见。
5. 使用超声机的显示屏上的"3D全卷 "选项， 如图2C显示左心室两个垂直图像- D然后最大化正在通过选择"FV选卷"中获取的扇区宽度。通过暂时关闭机械通气，按"采集"来获得完全的体积测量暂停通风。
6. 回波采集后，确保尖端是解锁操作件灵活。然后慢慢从动物取下探头。
   注意:不要离开日Ë动物无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。
7. 如前面所述的¹⁹与验证软件进行离线分析。

3.基于纳 - 压力 - 容量环采集

1. 预浸泡7 F四极导纳导管的感测提示在0.9％盐水（室温至37℃）至少20分钟，以确保在实验²⁰中适当的水分和最小的基线压力漂移。
2. 如第1节管理药物和麻醉。
3. 进行手术准备和前面⁵所描述获得的血管通路。
   1. 总之，刮胡子，清洁颈部。消毒用碘2％手术区并覆盖用无菌手术单猪的非无菌部分。
   2. 使在颈部内侧切口，以暴露颈动脉和颈内静脉。插入8 F鞘进入颈动脉和一个9 F鞘进入颈静脉。
4. 通过在颈静脉的9 F鞘插入的Swan-Ganz导管（SG）导管，并通过在导管的尖端膨胀球囊楔它在一个小肺动脉。在肺的外周部适当放置后，放气的气球。神光连接到外部心脏输出设备。
5. 附上包含0.9％的无菌盐水以连接到管腔与最接近河口注射端口20毫升注射器。测量加入5ml 0.9％盐水（室温）的快速输液心输出量，将获得心脏费率来计算每搏输出量（SV）。重复此步骤三次，取其平均值SV。
   注:心输出量是（自动地）使用斯图尔特汉密尔顿热稀释方程计算，并且基于在温度变化在室温²¹生理盐水输液肺动脉。
6. 取下导管SG。通过在上下腔静脉颈静脉和它的位置9楼鞘插入8 F导管福格蒂。
7. 校准用" 场 "和" 精细 "按钮光伏循环导管的压力信号，而尖端保持在0.9％的盐水。然后输入所测量的SV到系统中。
8. 通过在颈动脉中的8 F鞘前进光伏循环导管和在透视下左心室（LV）的居中的顶端。
9. 经密谋反对的压力信号的原始电导信号选择最大充分放置段。确保压力电导循环是矩形形状的。相位信号预计将显示3和5度之间用值的窦跟踪。暂停通风和执行基线扫描到电导转换成卷。
   1. 接受基准数据按下" 继续 "时的信号是稳定的（无心律失常），心脏速率等于心电图或压力衍生心脏速率和收缩末期（ES）/舒张末期（ED）电导由系统²⁰被适当地感测。
      注:后者可以通过绘制对压力信号的原始电导信号和比较从基线衍生的ES / ED电导值扫描到实时电导进行验证。如果任何上述要求没有满足，重复上述步骤。
10. 通过暂停通气呼吸暂停12次连续 - 通过记录10获得基线压力容积环。
11. 充气透视引导下，福格蒂导管，以减少负荷和记录10 - 如上所述，连续12次。确保收缩压保持> 60毫米汞柱和无心律失常与干扰测量。
12. 取出福格蒂和PV环导管。保持记录动脉PRESSUR之前和除去光伏循环导管的期间E要启用修正压力漂移（ 即， 离体前后的程序基线压力差）。
    注意:不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。
13. 执行几何测量和验证与²²软件功能参数进行离线分析。

4.区域在风险（AAR）和梗死面积（IS）定量

1. 溶解在50毫升0.9％盐水1.00克伊文思蓝（小心^23，中毒性），分别填充两个50毫升的路厄锁注射器用20毫升和30毫升2％伊文思蓝溶液，并保持在室温下。
   注:在通风橱工作，并佩戴防尘面具，以限制暴露于有害粉尘和使用手套和防护眼镜，以防止接触FR嗡皮肤和眼睛。
2. 采取类似的预防措施，溶于37℃的0.9％生理盐水1％2,3,5-三苯基tetrazoliumchloride（TTC）（注意，刺激物），并保持在37℃。
3. 手术准备的动物获得的血管通路既颈动脉。执行胸骨切开，以允许在体内 Evans蓝输注⁵的效果直接可视化。
4. 插入一个7 F和在各自的颈动脉的8 F引入鞘。可替代地，在一个单颈动脉插入两个导引鞘或使用股动脉中的一个为两个引导导管中的一个。
5. 连接两个标准的Y型连接器，一个7 F JL4和8 F JL4分别导引导管。对于股的方式，使用JR4为右冠状动脉（RCA）和左冠状动脉主干一个JL4（LCMA）。连接10厘米的延长到两个Y型连接器的附加三通旋塞。
6. 辖100 IU / kg的肝素。在8 F JL4指导CA的位置theter在通过两个导引鞘中的一个的左主干的口。
7. 用0.014"导丝，推进冠状动脉扩张导管通过导管LCMA在其中MI诱导过程中进行冠状动脉闭塞的部位气球的位置。但不要夸大。
8. 通过第二导引鞘在RCA的口第二个8 F JL4导引导管位置。
9. 通过在透视下注入造影剂，以确认这两个导引导管的正确定位和在冠状动脉中的气球，使用前后和LAO 30°次执行冠状动脉造影（CAG）。
10. 附加含有30毫升（LCMA）和20毫升（RCA）的2％伊文思蓝向附着在引导导管的Y连接器的各个三通抽头的50mL的注射器中。
11. 充气气球，并确认由CAG冠状动脉闭塞。只有当气球完全阻断任何造影剂的通道，注入伊文思蓝ð靠着而气囊膨胀都导引导管（5毫升/秒）。
12. 伊文思蓝灌注完成后直接通过放置一个9伏电池对心脏的非梗死引起部分心室颤动。
13. 切开腔静脉以释放压力，并确保抽吸单元可用，以允许血液引流。
14. 放气气球，既引导导管一起收回，并通过解剖周围的膜外植体心脏。通过大血管（ 即主动脉，肺动脉/静脉）切的横向允许完整的外植。迅速洗掉血液和多余染料上的外表面，然后使用0.9％盐水中的心腔。
15. 小心解剖左心室和从顶点使削减5相等厚10毫米的部分至基部，平行于房室沟的平面。
16. 拍摄分别在环境光条件下的所有五个切片的两侧，作为一个可能的伊文思蓝的洗脱可在随后的步骤进行。为了校准，确保一把尺子出现在影像中。
17. 孵育在37℃下在1％TTC溶液10分钟，5分钟为等于染色后扭转的部分。
18. 此外，拍摄所有五个片的两侧分别在环境光线条件，并确保一个标尺标定图像中可视化。
19. 权衡所有切片。适合分析⁵使用的软件。当使用ImageJ（1.47版），点击"直线"按钮。现在，绘制与图像（ 例如 ，5厘米），在用标尺已知距离的直线。点击"分析" - >"设置规模"，并在框中输入距离"已知的距离"。这个过程允许在像素长度的SI单位距离的校准。
20. 使用"多边形选择"按钮，选择对应于左心室心肌在目前IM总面积年龄，单击"分析" - >"办法"获得测量结果。执行此过程对心肌的每个切片的两侧，和每个切片的平均值。
    1. 通过切片成比例的所有五个切片的总重量的重量相乘并平均这些测量结果用于所有切片。
21. 在风险（AAR）和梗死面积（IS）执行的区域类似测量。鸿沟/ AAR，AAR / LV和IS / LV和100％乘以以获得相应结果的测量^5。

结果

3D食管超声心动图

3D食管超声心动图（3D-TEE）可用于全球心脏功能的评估。 AMI后，全球心脏功能健康基线值不同。特别是，左心室射血分数（LVEF）从59±4％至37±6％再灌注后的一周（10）（GPJ面包车豪特，2015）后降低。在行程容积（74±11对47±8毫升）的收缩末期容积（51±7 82±13毫升）和下降的增加，也观察到?...

讨论

心脏重塑在很大程度上取决于心肌梗死面积和心肌梗死的质量修复^6,26。评估以标准化的方式前，本手稿提供伊文思蓝与体外 TTC染色，已验证和广泛使用^8,16,27,28联合体内输注优雅方法。这种方法允许在危险中（AAR）就AAR ¹⁶的区域的量化和梗塞大小。目前的做法降低了染料扩散到AAR，梗塞区域或风险 - 与malpositioning - 乳头肌的，因为它不要求心肌穿刺。此外，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-dimensional Transesophageal Echocardiography
iE33 ultrasound device	Philips	-
X7-2t transducer	Philips	-
Aquasonic® 100 ultrasound transmission gel	Parker Laboratories Inc.	01-34	Alternative product can be used
Battery handle type C (laryngoscope handle)	Riester	12303
Ri-Standard Miller blade MIL 4 (laryngoscope blade)	Riester	12225
Qlab 10.0 (3DQ Advanced) analysis software	Philips	-
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pressure-volume loop acquisition
Cardiac defibrillator	Philips
0.9% Saline	Braun
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
9 F Radifocus® Introducer II Standard Kit	Terumo	RS*A90K10SQ	Alternative product can be used
8 F Fogarty catheter	Edward Life Sciences	62080814F	Alternative product can be used
7 F Criticath™ SP5107H TD catheter (Swan-Ganz)	Becton Dickinson (BD)	680078	Alternative product can be used
Ultraview SL Patient Monitor and Invasive Command Module (external cardiac output device)	Spacelabs Healthcare	91387	Alternative product can be used
ADVantage system™	Transonic SciSense	-
7 F Tetra-polar admittance catheter (7.0 VSL Pigtail / no lumen)	Transonic SciSense	-
Multi-channel acquisition system (Iworx 404)	Iworx	-
Labscribe V2.0 analysis software	Iworx	-	Alternative product can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Infarct size / area-at-risk quantification
Diathermy	-		Alternative product can be used
Lebsch knife	-		Alternative product can be used
Hammer	-		Alternative product can be used
Bone marrow wax	Syneture		Alternative product can be used
Klinkenberg scissors	-		Alternative product can be used
Retractor	-		Alternative product can be used
Surgical scissors	-
7 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08703	Alternative product can be used
8 F Percutaneous Sheath Introducer Set	Arrow	CP-08803	Alternative product can be used
7 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34357-662	Alternative product can be used
8 F JL4 guiding catheter	Boston Scientific	H749 34358-662	Alternative product can be used
COPILOT Bleedback Control Valves	Abbott Vascular	1003331	Alternative product can be used
BD Connecta™	Franklin Lakes	394995	Alternative product can be used
Contrast agent	Telebrix
Persuader 9 Steerable Guidewire 9 (0.014", 180 cm, straight tip), hydrophilic coating	Medtronic Inc.	9PSDR180HS	Alternative product can be used
SAPPHIRE™ Coronary Dilatation Catheter (PTCA balloon suitable for the size of the particular coronary artery (2.75 - 3.25 mm))	OrbusNeich	103-3015	Alternative product can be used
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-100G	Toxic. Alternative product can be used
2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	T8877-100G	Irritant. Alternative product can be used
9 V Battery	-	-
Ruler	-	-
Photocamera	Sony	-
ImageJ	National Institutes of Health	-	Alternative product can be used