诱导多能干细胞使用成纤维样滑膜生成类风湿关节炎患者的关节分离

摘要

在这里，我们描述了从患者来源的成纤维细胞样滑膜细胞产生的诱导的人多能干细胞，使用慢病毒系统无饲养细胞的协议。

摘要

成熟的体细胞可以使用一组已定义的重编程因子被逆转成多潜能干细胞样的状态。的Oct4，Sox2的，Klf4的和c-Myc:大量的研究已经通过转导4山中转录因子产生的各种体细胞类型的诱导多能干细胞（iPS细胞）。 iPS细胞的研究仍然是生物学和临床研究的前沿。特别是，患者特异性iPSCs的可以被用作疾病病理学的研究开拓工具，因为iPSCs的可以从任何个体的组织进行诱导。类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎性疾病，软骨和骨结构中的关节的破坏分类。滑膜增生是导致这些结果在RA中的主要原因或症状之一。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSS）是在增生的滑膜的主要成分的细胞。 FLSS在合资无限增殖，最终侵入相邻cartil年龄和骨骼。目前，增生性滑膜只能通过外科手术去除。移除的滑膜用于RA的研究作为反映关节的炎性病症的材料。如在RA的发病机理的主要参与者，FLSS可用作一种材料，以产生并调查RA患者的iPSCs的。在这项研究中，我们使用了RA患者的FLSS产生的iPSC。使用慢病毒系统，我们发现FLSS可以生成RA患者特异性的iPSC。从FLSS产生的iPS细胞可以进一步用来作为一种工具来研究RA的病理生理的未来。

引言

多能性干细胞是在不同的临床和生物领域的下一代平台。它们是一种很有前途的工具，可以在疾病建模，药物筛选，并再生医疗治疗中使用。人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）主要用于研究和理解多能细胞。然而，由人胚泡的破坏分离，人类胚胎干细胞与几个伦理问题相关联。 2007年，山中伸弥博士和他的团队逆转细胞编程过程和成人的体细胞^1,2开发干细胞。因此，与人类胚胎干细胞，诱导多能干细胞（iPS细胞），可以从成熟的体细胞中产生，避免了伦理障碍。

的Oct4，Sox2的，Klf4和c-Myc的:通常，由四个外源基因递送产生的iPSC。这些因素山中正在使用慢病毒和逆转录病毒系统最初交付。第一iPS细胞是从鼠体细胞衍生Ç厄尔^3。然后，将技术应用于人皮肤成纤维^1,2。随后的研究成功生成从各种来源，如尿^4，血液^5,6- iPSCs的，角质⁷和其他一些类型的细胞。然而，也有没有在重新编程中使用的一些体细胞，并从在疾病状态特异组织的各种细胞类型的重新编程能力筛选，仍然需要。

类风湿关节炎（RA）是一种可以攻击所有关节，并导致在其他器官自身免疫疾病的疾病。 RA影响在发达国家成年人约1％。这是一种相当常见的疾病和其发病率逐年增加^8。然而，RA是很难在早期识别和摧毁oncebone发生没有治疗，可以恢复的损害。此....

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研究方案

伦理学声明:本研究方案被批准由韩国天主教大学（KC12TISI0861）的机构审查委员会。

1.滑膜细胞分离和扩增

1. 隔离滑膜
   1. 消毒2双手术剪和一对钳。
   2. 转移滑膜组织到100mm皿并用含有1％青霉素/链霉素5毫升磷酸盐缓冲盐水的（PBS）中洗涤。
   3. 切断淡黄色脂肪组织和骨的残基。转移修整组织到一个6孔板的孔中加入5 ml Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），用20％胎牛血清（FBS）的。
   4. 剁用剪刀组织直至件小到足以穿透一次性吸。
   5. 含组织媒体传送到50ml锥形管中。通过加入5ml DMEM中，用20％的FBS的6孔板收获剩余的材料，然后转移到管中。
   6. 在冰上解冻胶原酶。添加胶原酶到0.01％的终浓度和密封用封口膜的管。孵育在水浴在37℃振荡4小时。
   7. 温育后，填充有20％FBS的DMEM管，直到总体积为50 ml和离心机在300 xg离心，室温10分钟。
   8. 不干扰沉淀除去上清液并加40毫升培养基重悬沉淀。
   9. 重复步骤1.1.10-1.1.11。
   10. 重悬在25毫升的DMEM的沉淀，用20％FBS和等待组织的大的团块，以沉底。
   11. 将上清转移至100毫米培养皿，并在5％CO ₂在37℃下孵育14一天。
2. 滑膜维护和扩展
   1. 丢弃从板的使用的媒体，....

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结果

在这项研究中，我们描述了一种协议使用的慢病毒系统生成从FLSS的iPSC。 图1A示出了FLS隔离协议的一个简单的方案。继手术切除滑膜，组织被切成采用手术剪小块。加入胶原酶向细胞从组织的团块隔离。细胞进一步处理前温育14天。 图 1B示出的分离的FLSS的形态。细胞保持在使用前3的通道。 FLSS共享一般的成纤维细胞的类似特性。我们?.......

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讨论

iPS细胞的发现之前，科学家主要用于胚胎干细胞通过差异化来研究干细胞生物学和其他细胞系。然而，胚胎干细胞从胚泡，这是一个早期胚胎的内质起源。为了分离胚胎干细胞，囊胚破坏是不可避免的，提高是不可能克服的伦理问题。此外，尽管胚胎干细胞具有干性特征和多能性，它们不能从个体获得的，并且有时不进行个性化的分析和疾病筛查的理想工具。

在2007年，高桥.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004