植入和无线电图记录和视觉诱发电位清醒大鼠

摘要

我们显示手术植入和记录程序，以测量从眼睛（视网膜电流图）和清醒大鼠脑（视觉诱发电位），这是更类似于在那里记录被无麻醉的困惑进行的人的条件视觉电生理信号。

摘要

满场电图（ERG）和视觉诱发电位（VEP）是评估在实验室和临床环境视网膜和视觉通路的完整性的有用工具。目前，临床前ERG和VEP测量是在麻醉下进行，以确保稳定的电极位置。然而，麻醉的非常存在已经显示出污染正常的生理反应。为了克服这些麻醉的困惑，我们开发了一个新的平台，以测定ERG和VEP清醒大鼠。电极植入手术子conjunctivally对眼睛的测定ERG和硬膜外在视觉皮层测量VEP。振幅和灵敏度的范围/时序参数在提高发光能量测定两个ERG和VEP。在ERG和VEP信号被证明是稳定的和可重复的至少4周后手术植入。该记录ERG和VEP信号，无需麻醉能力混淆了临床前小号ETTING应以临床数据提供的高级翻译。

引言

在ERG和VEP 在体内工具微创以评估分别在实验室和临床既视网膜和视觉通路的完整性。全视野ERG产生的特性波形可被分解成不同的组件，与代表视网膜通路^1,2的不同细胞类的每个元素。经典的全视野ERG波形由一个初始负斜率（a波），这已被证明是表示感光体的活性交曝光^2-4。在一个波之后是反映中央视网膜，主要是接通双极细胞^5-7的电活动的实质性利好波形（B波）。此外，一个可以改变光的能量，相互刺激间隔从杆反应⁸隔离锥。

闪光VEP代表了视觉皮层和脑干的电势响应视网膜光刺激^9,10。该波形可以被分解成早期和晚期的组件，与早期部件反射的眼膜-geniculo具条纹通路^11-13和表示在各种V1薄片大鼠^11,13进行皮质加工后期成分的神经元的活性。因此，ERG和VEP的同时测量返回参与视觉通路结构的综合评估。

目前，为了记录在动物电，麻醉采用使电极稳定放置。已经出现了以测量ERG和VEP清醒大鼠^14-16尝试但这些研究中采用的有线设置，这可能是麻烦的，并且可以通过限制动物的运动和自然行为¹⁷导致动物的压力。随着无线技术的最新进展，包括改进的小型化和电池寿命，现在有可能实现对ERG的遥测方法ðVEP记录，减少与有线录音和提高长期存活率带来的压力。遥测探针内部充分稳定注入已被证明是成功的为体温，血压^18，活动¹⁹的慢性监测以及脑电图^20。技术的这种进步还将协助重复性和意识录音稳定性，提高了平台的实用程序，用于慢性研究。

研究方案

伦理学声明:动物实验均按照与动物科学为目的的护理和使用（2013年），澳大利亚代码进行。从动物伦理委员会，澳大利亚墨尔本大学，获得动物伦理委员会批准。此处所用材料是用于实验室实验而已，并非用于医疗或兽医用途。

1.准备电极

注意:一个三通道发射机被用于手术植入使2 ERG和1 VEP记录可以同时进行。三种活性和三个非活性电极需要被预先制作成在植入前的环形状，以附加到眼球。用于识别目的，制造商已积极封闭电极半白，一半是彩色塑料护套而不活动的电极覆盖全彩色护套。接地电极（透明塑料护套）将保持不变。对于所有的活动和非活动ELECTR颂歌行为步骤1.1，1.2，1.3和1.7。

1. 解开两个细尖钳双链不锈钢焊条。
2. 修剪不锈钢单股线（从尖端约1cm）中的一个，使剩下的塑造环电极的单个长直链。
3. 折叠单个不锈钢丝返回到本身和扭曲，形成在电极的尖端平滑环。
4. 用于ERG有源电极时尚该环路〜0.2 - 0.5毫米的直径通过扭绞循环的碱（这里所描述的目的，形状以这种方式从双眼记录ERG两个活性电极），和用于ERG不活动和VEP电极使环直径〜0.8毫米直径（在这个例子中，对于一个有源VEP电极和所有的三个非活动电极做）。
5. 钩围绕的不锈钢螺杆（直径0.7mm时，长度3毫米），所以在电极靠在螺钉头的圆形VEP活性电极。
6. 胡胡ķ围绕第二个不锈钢螺丝（直径0.7mm时，长3毫米），3个非活动电极（2 ERG，1 VEP）。
7. 向前拉塑料套在两个不锈钢链的末端锐利，以减少刺激。
8. 通过在大约25℃下在2％戊二醛浸泡超过10小时消毒遥测发射机。然后用清水冲洗用无菌生理盐水3次发射。

2.发射器植入

1. 动物的制备
   1. 通过用70％乙醇清洗前消毒手术区到实验。使用前高压灭菌所有手术设备和洗必泰维护设备在不手术过程中使用。盖在手术过程中与外科被单的动物保持无菌环境。确保所有实验者戴上医用口罩，无菌手套和礼服。
   2. 诱导用1.5麻醉 - 2％异氟烷，以3升/分钟和maintai流速1.5定义 - 2％，至2升/分钟整个手术。在捏脚趾之间的肌肉被确认没有踏板反射麻醉足够的深度。
   3. 从腹股沟到胸骨上述剃40毫米×30mm的区域上腹部。
   4. 剃30毫米×20mm的区域中的前额，后对眼睛和前到耳朵。
   5. 消毒这两个剃领域。对于额头部位消毒用10％的碘伏三次（避开眼睛附近的区域用含酒精的消毒剂，是与实践的标准一致列明外科技师协会）​​。在腹部消毒用10％聚维酮碘和70％乙醇。
   6. 应用proxymetacaine 1滴在角膜上额外的表面麻醉。
   7. 应用羧甲基纤维素钠的1滴至角膜以防止眼睛干燥。
2. 手术植入
   1. 让10毫米的切口沿着用外科手术刀两耳之间的垂直中线的头部。
   2. 使上腹部有5毫米的切口，通过沿胸骨下方中线皮肤层。
   3. 隧道从腹部切口的头部切开一个5mm直径的套管皮下。
   4. 通过从腹部到头部插管订阅发射机的电极布线（3活性和3不活动）。
   5. 离开与发射机碱参考电极和覆盖无菌纱布电极尖端。
   6. 盖上无菌纱布电极尖端（3有源和3个非活动）。
   7. 老鼠的头固定到一个立体平台。
   8. 延长切口额头到30毫米的长度与手术剪。
   9. 在3〜点和9点 - 通过收缩松弛的皮肤与缝线2（O 3）暴露手术区。
   10. 刮去骨膜覆用消毒纱布暴露前囟，Lambda和中线缝合头骨。
   11. 通过在VEP活性颅骨钻两个孔（7毫米腹侧前囟3毫米横向中线）和非活性（5毫摩喙前囟上中线）立体坐标。
   12. 附加VEP活性和非活性电极与预安装的不锈钢螺丝（直径0.7mm时，长3毫米），颅骨用小螺丝刀到〜1毫米的深入到预制孔。此锚定螺钉在骨不破坏底层皮层组织。
   13. 植入视网膜电图电极积极使用8 - 0缝合暂时收回上眼睑。
   14. 通过向上级结膜穹窿插入从眼睛后面的16至21g的套管皮下。
   15. 取出针指导。
   16. 从对眼睛额头饲料通过缩短塑料导管活性电极。然后取出塑料导管。
   17. 使用临时缝合（8 - 0），它是通过电极环螺纹，以防止ELEC处接上缩回回隧道。
   18. 让优越的结膜0.5毫米的切口位于12点位置，落后缘1毫米。使用钝性分离，露出底层的巩膜。
   19. 立即缝合0半巩膜厚度缘背后 - 植入一个8 - 0或9。
   20. 卸下ERG活性电极临时缝合。
   21. 通过把连续3结确保电极的顶端锚定ERG有源电极到半巩膜厚度缝合位于靠近角膜缘。
   22. 关闭使用1〜2间断缝合结膜瓣（8 - 0到9 - 0）。确保结膜完全覆盖ERG电极，以提高舒适性。
   23. 卸下眼睑回缩缝合。
   24. 用同样的方法对侧眼。
   25. 应用氰基丙烯酸酯胶在头骨，以确保所有的不锈钢螺丝和电极线。确保ERG主动电极不固定到连接前拉得太紧能够眼球运动。
   26. 0缝合 - 使用非吸收性3关闭头上的伤口。
   27. 旋转啮齿动物暴露腹部。延长腹部切开皮肤沿手术剪白线40毫米。
   28. 让35毫米的切口通过内肌壁，露出内腹腔。
   29. 使用两个缝线（3 - 0）发射体附着在动物的右侧内腹壁。避免接触肝。
   30. 环路接地电极，并在这个形状与缝线（3 - 0）的安全。把它放在自由浮动在腹腔内。
   31. 采用连续缝合（ - 0 3）关闭腹膜。
   32. 关闭使用间断缝合（3 - 0）皮肤切口。
3. 术后护理
   1. 监测动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。房子动物单独继手术。
   2. 辖carpr奥芬皮下镇痛（5毫克/千克）一次，连用4天。
   3. 到饮用水加预防性口服抗生素（Enrofloxin，5毫克/公斤）7天手术后。
   4. 适用的抗炎软膏皮肤切口部位以减少刺激的第7天手术后。

3.进行ERG和VEP录音清醒大鼠

1. 暗适应动物的ERG和VEP录音前的12个小时
2. 开展昏暗红光（17.4 cd.m ^-2，λ _最大 = 600纳米）的所有实验操作
3. 应用表面麻醉（0.5％proxymetacaine）和扩张（0.5％托）下降到角膜。
4. 引导意识的啮齿动物成定制的，清晰的限制器。
   注意:此塑料管的长度可以调整，以适应不同大小的大鼠固定在60毫米的总直径。该装置的前端部是锥形的，以减少头部莫vement并包含穿孔，使正常呼吸。该锥形前允许对准和老鼠的头部和眼睛的稳定的Ganzfeld球体的开口。需要注意的是啮齿动物已被驯化的限制器（3至5次）在手术前。
5. 放置在Ganzfeld碗与碗的开口对准眼睛前方的啮齿动物。
6. 通过传递〜5厘米发射机内的磁体打开留置发射机。验证发射器是通过检查接收器底部的LED状态指示灯。
7. 如前面描述的²¹集在一定范围内发光的能量（即 -5.6至1.52日志cd.sm ^-2）的信号。简单地说，在调光照明水平（〜80重复）和更少的平均多个信号的明亮发光的能量（约1重复）。逐步延长为1至180秒，从最暗到最亮光照强度刺激间隔。
8. 要隔离杆ERG和锥反应利用双闪光灯模式^8。例如，在启动日志1.52 cd.sm闪烁两次^-2，500毫秒刺激间隔在两者之间。
9. 以记录VEP信号，平均20重复在明亮发光的能量（ 即，1.52日志cd.sm ^-2，5秒刺激间间隔）。
10. 为了评估植入物的稳定性，这是由信号变化随着时间的推移评估，进行ERG和VEP录音7，10，14，21和28天手术后。
11. 甲苯噻嗪麻醉（12:1毫克/千克）如下的实验期间，通过氯胺酮后pentobarbiturate的心脏内注射（1.5毫升/公斤）安乐死大鼠。

结果

感光体响应由在顶部2的发光能量（1.20，1.52日志CSM ^-2）对于每个动物拟合延迟高斯到ERG响应的初始下行肢的前缘分析的基础上，羊肉和普格的模型^22日 ，胡德和桦木²³制定。此公式返回一个幅度和灵敏度参数，（ 图1C和1D，分别）。双曲线函数拟合为每个动物杆双极细胞的光能量响应，这也返回一个幅度和灵敏度参数，（?...

讨论

由于视觉电生理的微创性，在人类患者ERG和VEP录音意识的条件下进行，只需要放置电极使用局部麻醉剂的。与此相反，在动物模型中视觉电全身麻醉下常规地进行通过消除自愿眼睛和身体动作，以使稳定的电极放置。然而，常用的全身麻醉药改变如由我们以前出版²⁴和 ​​其他^25-27 ERG和VEP反应。在啮齿动物模型有意识ERG和VEP平台的这种发展提供了在动物模型中的生理反应，其可以...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioamplifier	ADInstruments	ML 135	Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5%	Pfizer Animal Health Group	CAS 53716-49-7	Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator	RS components	473-439	Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel	RS components	473-423	Fix stainless screws to skull
Dental burr	Storz Instruments, Bausch and Lomb	E0824A	Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill	Bosch	Dremel 300 series	Automatic drill for trepanning
Enrofloxin	Troy Laboratories		Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere	Photometric Solutions International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment	Aspen Pharma Pty Ltd		To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs	Phillips Lighting Co.		For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery)	World Precision Instruments	501959	for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery)	World Precision Instruments	500224	To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter	Smiths Medical International LTD	16 or 21 G	Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML 785	Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Restrainer	cutom made		Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm.
Scapel blade	R.G. Medical Supplies	SNSM0206	For surgical incision
Scissors (macrosurgery)	World Precision Instruments	501225	for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver	Oster	Golden A5	Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws	MicroFasteners	L001.003CS304	0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 900	A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery)	Ninbo medical needles	3-0	for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery)	Ninbo medical needles	8-0 or 9-0	for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter	DataSciences International	R08	allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix	DataSciences International		Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver	DataSciences International	RPC-1	Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter	DataSciences International	F50-EEE	3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5%	Alcon Laboratories		Iris dilation
Tweezers (macrosurgery)	World Precision Instruments	500092	Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery