骨髓祖细胞的逆转录病毒转导到生成T细胞受体Retrogenic小鼠

摘要

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

摘要

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

引言

人类和小鼠的T细胞受体（TCR）剧目估计为1×10 ⁸ 2×10 ^6个独特的TCR分别^1,2。这个大多样性使T细胞能够识别来自自身肽，以及从由抗原呈递细胞（APC）的主要组织相容性复合体（MHC）颁发的病原体衍生的抗原表位的繁多。在这个独特的肽MHC复合物的TCR的相互作用的细微差别决定T细胞是否发生凋亡，无能，活化，分化，细胞因子的产生和细胞毒性。但是，由于大的T细胞受体库的一个特异性TCR将如何对特定抗原作出反应的分析需要使用单一的TCR系统。

各种TCR转基因小鼠已为了研究单一的TCR的功能在体内模型^3-9生成的。然而，有警告到TCR转基因小鼠，包括成本，时间，以产生一个单一的转基因小鼠和随机转基因插入的所谓的创始人作用到种系的DNA ¹⁰的长度。因此，已经产生相对少的TCR转基因小鼠为任何给定抗原和高和低TCR的亲和力为相同的表位的功能影响很少讨论。为了满足迅速的方法来屏的需要，单独地或组合研究多种的TCR，（来自逆转录病毒的"逆向"和从转基因"基因"）retrogenic小鼠已被利用作为替代TCR转基因小鼠的^11-13。

内几种病毒中发现的2A肽共有基序包含一个2A-ASP-缬氨酸/异亮氨酸 - 戊二醛-X-ASN-Pro的基-Gly-2B-Pro的，其中的2A的甘氨酸和2B的脯氨酸之间发生裂解从顺式短效水解酶活性，导致核糖体跳绳翻译^10,14-16中。有关详细的图描绘的C各种2A肽（F2A，E2A，T2A和P2A）的leavage请参阅参考文献10 - 12以这种方式，2顺反子（TCR的α和TCR测试版）可以链接导致单个载体化学计量的翻译。利用这种方法，我们都能够表达和体内直接比较多个抗原特异性的TCR。

研究方案

伦理学声明:尽一切努力在辐射和尾静脉注射到动物的不适或压力保持在最低水平。小鼠被用作这些实验中的细胞源;因此不存在程序或操作除了安乐死。小鼠将CO ₂吸入颈椎脱位确认死亡安乐死。这个过程是在美国兽医协会的安乐死小组的建议相一致。

1.准备逆转录病毒构建

1. 子克隆的T细胞受体（TCR）的α和β链，由一个2A接头分开，到基于MSCV逆转录病毒¹¹载体（例如，pMIAII或^{pMIGII）11。}
   注:2A链接允许从单个开放阅读框的α和βTCR链的化学计量和一致表达。该载体包括用于将IRES荧光蛋白盒（紫黄或绿色荧光蛋白）跟踪转导的细胞和转染效率。对于一个详细的协议，请参阅霍尔斯特等^。11
2. 使用商购获得的血浆prep试剂盒或类似的产品分离质粒DNA。使用1工作浓度- 2微克微升^-1。

2.代逆转录病毒生产细胞系的

1. 利用两步过程，以产生反转录病毒生产细胞系。
   注:对于一个详细的协议，请查看霍尔斯特等^[11]。
   1. 通过生成293T细胞有三个质粒（pVSVG，PEQ-PAM3（-E）和利息¹¹向量）的瞬时转染逆转录病毒，并采取逆转录病毒上清从293T细胞转导的GP + E86嗜性逆转录病毒生产者细胞系。
   2. 通过FACS分离荧光表达GP + E86生产细胞的顶端40％和传播transdcuced-GP + E86生产细胞作为病毒的来源。
      注:代的高滴度生产为骨髓细胞的有效转导的关键。对于一个完整的协议，请查看霍尔斯特等^。11

3.逆转录病毒介导的干细胞基因转移（天-5）

1. 解冻并在完全DMEM各GP + E86生产者细胞系的培养0.5 -1.0×10 ⁶ 10％（体积/体积）胎牛血清，以允许两个汇合150毫米板足够的生长通过该协议的第0天。
   注:解冻0.5 -在10cm平板各GP + E86生产者细胞系的1.0×10 ⁶将允许30 - 50％汇合在5天这还允许培养5天，以扩大在GP + E86生产者细胞系两个融合150毫米盘由0天。
   1. 在含有5％羊小牛血清，和环丙沙星（10微克/毫升），以避免支原体污染的完整组织培养基培养反转录病毒生产细胞系。
      注意:当generatin停止使用环丙沙星克骨髓转导的病毒上清。避免生产细胞系的过度增长，因为这会产生负面影响骨髓的转导效率。

4.注入供体小鼠与5-氟尿嘧啶（5-FU）（-3天）

1. 称量供体小鼠（5 - 19周龄），以确定的5-FU所需的量。利用老鼠超过5周低骨髓产量的年龄结果年轻。为了确保单个TCR表达，使用T细胞缺陷的小鼠品系，如SCID，抹布或TCR阿尔法缺陷小鼠的骨髓捐赠者。
2. 在组织培养罩工作，淡化的5-FU的库存用无菌PBS以使足够量的10毫克毫升^-1的5-FU工作溶液每克体重的递送0.15毫克的5-FU。
3. 用1ml注射器用37克针，腹膜内注射每克供体小鼠体重0.15毫克的5-FU。
   注:每一个收件人使用1捐助鼠标启动和调整根据细胞产量的供体小鼠的数目。的5-FU处理的骨髓祖细胞的富集和分离的另一种方法是如在Viret 等人所述谱系阳性细胞的阴性选择。

5.骨髓提取程序（第0天）

1. 获得清扫剪刀和镊子骨隔离。制备培养基（HBSS补充了5％FCS（体积/体积））收集在50ml锥形管中的骨头。保持含冰介质50毫升锥形。通过安乐死CO ₂小鼠吸入颈椎脱位确认死亡。捏爪子，以确保没有检测到反射。
2. 消毒手术部位，并用乙醇或甲醇手术工具。首先切割和骨盆带下小心地取出股骨，胫骨，肱骨，和骨盆带。切割沿股骨胫骨回落。删除使用剪刀和镊子获得干净的尸骨周围的组织。保持骨头在HBSS + 5％（体积/体积）FBS的水合。
3. 通过在关节处切割，确保两头切掉每块骨骼分离的骨头。插入连接到在含HBSS + 5％（体积/体积）10毫升注射器FBS的25号针头。施加压力，并通过在50毫升的锥形70微米的过滤休息刷新所有的骨髓。
4. 周期性地，通过使用柱塞从1毫升或3毫升注射器的70微米的过滤器推骨髓。冲洗用HBSS + 5％（体积/体积）FBS的过滤。这将确保单细胞悬浮液，是免费的骨碎片和组织。保持细胞在无菌罩执行该过程无菌的。
5. 离心机的骨髓细胞在300×g离心在4℃下10分钟。

6.骨髓培养（第0天）

1. 倒出或抽吸的介质，并在每50毫升的锥形管1毫升氯化铵根据红细胞裂解液（RBC或裂解液当量）悬浮细胞沉淀。后1分钟温育在室温温度，通过加入10ml完全DMEM的20％（体积/体积）FBS的骤冷红细胞裂解液。
2. 离心细胞，在300×g离心在4℃下10分钟。
3. 滗析或在5ml完全DMEM 20％（体积/体积）FBS的抽吸上清，重悬的骨髓。算用Neubauer计数室中的细胞。
   注意:一般屈服应为约5 - 10％小鼠×10 ⁶细胞;然而，收率小鼠不同菌株而异。
4. 在30ml完全DMEM的20％（体积/体积）FBS补充有IL-3的板的骨髓细胞以每150毫米板4×10 ⁷个细胞的密度（20克毫升^{-1），IL-6（50}克·毫升^-1）和SCF（50克毫升^-1）。
   注:使用刚解冻分装细胞因子。不使用已经为2周以上冷冻和解冻一次以上或保持在4℃的细胞因子。
5. 在37°C孵育骨髓过夜（约24小时），用5％ _的 CO _2。

7。逆转录病毒生产者细胞培养（第0天）

1. 板3×10每150毫米板⁶的逆转录病毒生产细胞的18ml完全DMEM的20％（体积/体积）FBS。
2. 孵育逆转录病毒生产细胞在37℃下过夜。预计1500万的骨髓细胞中一种150毫米板（约2 - 3供体小鼠）。

8.逆转录病毒上清液（1天）

1. 第二天（约24小时后），通过与用0.45 10毫升注射器和过滤器直接绘制了逆转录病毒上清液关150毫米板的收获从生产者板（在步骤7中建立）的逆转录病毒上清液-μm注射器过滤。
2. 小心以18毫升新鲜完全DMEM 20％（体积/体积）胎牛血清代替除去的逆转录病毒上清液。
3. 补充有IL-3的经过滤的逆转录病毒上清液（20克毫升^{-1），IL-6（50}克毫升^{-1），MSCF（50}克毫升^-1），聚凝胺（聚凝胺）（6＆＃956;克·毫升^-1）。
   注:聚凝胺要新鲜制成每2个月，以避免逆转录病毒转导的疗效下降。

9.骨髓收获（1天）

1. 完成步骤8.3之后，收获来自步骤6.4的骨髓细胞和包含非粘附细胞介质转移到无菌的50毫升管中。
2. 用10毫升的PBS洗涤大力板和步骤9.1在50毫升锥形收集。如果有必要，重复清洗步骤。
3. 离心将细胞在300×g离心在4℃下10分钟，倒出上清液，在小体积重悬细胞（1 - 3毫升）完全DMEM 20％（体积/体积）FBS和计数。预期50 -从第0天悬浮骨髓以每1毫升含细胞因子和聚凝胺的反转录病毒上清液的1×10 ^6个细胞的75％的恢复。

10.骨髓转导（1天）

1. 板逆转录病毒上清液/马骨以每井3毫升6孔组织培养板中的体积rrow混合物。裹保鲜膜板，以尽量减少在步骤10.2离心过程中的气体交换。
2. 旋缠绕6孔板在1000 xg离心60分钟37℃。
3. 自旋完成后，取出保鲜膜，并放置在板在37℃ _的 CO ₂培养箱中24小时。

11.逆转录病毒上清液和转导（第2天）

1. 24小时后，收集病毒生产者细胞系新鲜病毒上清。使用10毫升注射器和0.45微米的注射器过滤器过滤该反转录病毒上清液。补充有IL-3的经过滤的逆转录病毒上清液（20克毫升^{-1），IL-6（50}克毫升^-1）和SCF（50克毫升^-1），聚凝胺（6克毫升^-1）。
2. 接着，小心地用移液管除去或从6孔板的每个孔中含有的骨髓细胞吸出前2毫升媒体。
   注:工作小心不要吸出骨髓，这通常是集中在井的中间。可替代地，除去上清液可纺向下收回任何丢失的骨髓细胞。
3. 向每个孔中的骨髓6孔板加入3毫升新鲜病毒含有上清液的细胞因子和聚凝胺的。包裹在塑料板，并重复旋转以1000 xg离心60分钟37℃。解开的板，并在37℃和5％CO ₂的过夜（约24小时）孵育细胞。

12.加入新鲜DMEM加味（3日）

1. 24小时后，从含有骨髓细胞，在6孔板的各孔中除去前2毫升媒体如步骤11.2。用新鲜的DMEM的20％（体积/体积）FBS补充有IL-3的最终浓度替换除去的介质（20克毫升^{-1），IL-6（50}克毫升^-1）和SCF（50克毫升^-1） 。
2. 孵育骨髓在37℃ _的 CO ₂培养箱中另外24小时平板。

13.收获转导骨髓（4日）

1. 24小时后，收集来自6孔板的骨髓细胞。用PBS大力洗涤板以去除所有非贴壁细胞。
   1. 离心细胞，在300×g离心10分钟，在4℃，倒出上清液。
   2. 重悬在PBS + 0.5％（体积/体积）的小体积（1ml）中的骨髓热灭活的FBS。保持细胞在冰上。
2. 以每骨髓条件的10微升样品和计数使用Neubauer计数板细胞。假设1 -每个收件人2捐助，产量将足以传输每个收件人鼠标至少4×10 ^6个细胞。悬浮骨髓中的PBS + 0.5％（体积/体积）的热灭活FBS足够体积注入200 - 每只小鼠300微升。
   1. 注入至少2×10 ^6个细胞与转导效率的25％（可以注入多达8×10 ^6个细胞）每只小鼠静脉注射。
      注:每骨髓细胞的两个6孔平板我们经常注入5受体小鼠。如果产率是相当低，应使用更供体小鼠直到能得到足够的骨髓数目。为了达到最佳的重组，至少5×10 ^5个转导（荧光阳性）应注入每个收件人。
3. 用微吸移管，采取的每骨髓条件10微升样品和流式细胞术基于所述荧光标记物（ 图^1A）11的表达通过流式细胞分析转导效率。
   注意:通常情况下，荧光阳性的细胞的百分比是25％和70％之间，这取决于构建体和逆转录病毒滴度。转导的骨髓细胞的必要数量以重构一个子致死量照射到鼠标可以根据转导效率而变化。该TRAN较低sduction效率，需要越多的骨髓细胞，相反，骨髓传导效率越高，所需用于重建细胞的数量较少。低于25％的转导效率是不理想的，并且可能导致重建和存活不足。为了确保最佳的骨髓恢复和转导效率，使用新鲜制备的组织培养基和细胞因子。当表达新的TCR利用retrogenic系统中，T细胞受体在体内的选择是未知的。根据每个人TCR亲和力，TCR选择在胸腺和外周T细胞表达会有所不同^17。

14.老鼠照射，骨髓注入和护理

1. 照射小鼠骨髓注射前一天（当天为第13步）。使用以下剂量:C57BL / 6小鼠（以及其它野生型株），900拉德; RAG1 ^{- / -}小鼠，500拉德; SCID小鼠，300拉德）。
   1. 阿莫西林地方受体小鼠（50毫克/公斤/天）或辐照前另一种抗生素水处理，并保持对抗生素骨髓注射后的头两个星期。
      注:最优辐射剂量可能不得不凭经验确定。
2. 对于注射，加载来自步骤13.1细胞成使用钝针立即注射前，则针改变到27号注射，驱逐任何空气，以避免空气栓塞1-ml注射器。加热灯下热老鼠，注入0.2毫升每只小鼠的骨髓的静脉注射。
   注意:不要让细胞坐在注射器任何时间长度或细胞将定居。
3. 监测小鼠每周，以确保它们保持健康。
4. 后5 - 6周，流血小鼠检查重构的GFP + /紫黄晶+和TCR共表达（ 图^1B）11的基础上。

结果

骨髓转导效率在协议的步骤13.3检查骨髓注入尾静脉静脉之前以代表骨髓转导的图（ 图1A），收获的骨髓的约10微升加至100微升PBS和紫黄晶表达分析。通常荧光阳性的细胞的百分比是25％和70％之间，这取决于构建体和逆转录病毒滴度。 6周骨髓注射后，将小鼠放血，以确定骨髓重建（ 图1B）。大约外周血25微升红细胞裂解并用抗TCRβ染色。在图...

讨论

在协议中，我们详细介绍几个关键步骤，以确保最佳的骨髓健康，传递效率和重建。第一个关键步骤是产生和GP + E86病毒生产细胞的适当的维修。使用早期传代生产细胞系，并在80％汇合或使用较低前保持。当制作新鲜的GP + E86病毒生产细胞，保证了293T细胞是早期的通道，并在培养24成长 - 48小时。在转步电镀太多的GP + E86细胞会降低病毒滴度。如在霍尔斯等 ^11中所述，以确保GP + E86?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose + glutamine	Corning Cellgro	10-013-CV	Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µm syringe filter	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Sodium Pyruvate	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M solution	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoethanol	Gibco by Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutamine	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm tissue culture dishes	Greiner Bio-one	639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate	Greiner Bio-one	657160
70 µm nylon cell strainers	Falcon	352350
Mouse IL-3	Invitrogen	PMC0033
Human IL-6	Invitrogen	PHC0063
Mouse Stem Cell Factor	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Syringe	BD	300912
BD 1 ml Syringe	BD	309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305106