RNA结合蛋白的检测通过<em&gt;体外</em在脂肪细胞培养&gt; RNA下拉

摘要

的RNA下拉协议这里优化用于检测RNA结合蛋白（限制性商业惯例）和非编码以及编码RNA之间的相互作用。从雄激素受体（AR）的RNA片段作为例子来演示如何从初级的棕色脂肪细胞的lystate检索其RBP。

摘要

RNA结合蛋白（限制性商业惯例）正在成为在脂肪的发育和功能的调节层。限制性商业惯例通过影响靶mRNA的稳定性和翻译效率发挥在转录后水平的基因表达的调控中起关键作用。 RNA的下拉技术已被广泛用于研究RNA-蛋白质相互作用，这是必要阐明该机制底层限制性商业惯例'以及长的非编码RNA"（lncRNAs）函数。然而，高血脂丰度在脂肪细胞构成在进行该实验中一个技术挑战。这里详细的RNA下拉协议是初级脂肪细胞培养进行了优化。从雄激素受体的（AR）3'非翻译区含作为一个例子来说明如何检索其RBP合作伙伴的HuR蛋白质，脂肪细胞从一个lystate富含腺苷酸尿苷酸-elementwas（3'UTR）的RNA片段。可以应用这里描述的方法来检测之间的相互作用限制性商业惯例和非编码RNA，以及间限制性商业惯例和编码RNA。

引言

限制性商业惯例是结合在细胞中的双链或单链RNA和参与形成RNA-蛋白复合物的蛋白质。限制性商业惯例可以结合多种RNA分子，包括mRNA和长非编码RNA（lncRNAs），并在发挥转录后水平的影响力。限制性商业惯例和lncRNAs在脂肪发展逐渐成为新的监管机构和功能^1,2,3。理解RBP-的机制和细胞途径lncRNA介导的调节，它通常需要检测特定RNA分子和一个或多个限制性商业惯例之间的相互作用，并且，有时，以识别RNA的蛋白伴侣的全谱成绩单。然而，该实验可以是具有挑战性由于脂质的脂肪细胞的高含量。这里所描述的RNA的下拉协议可被用于检索来自原代培养^4,5的脂肪细胞裂解物的特定RNA的蛋白质的合作伙伴。

理这个原山口总结如下。的RNA诱饵是在体外从DNA模板转录，生物素标记和缀合到链霉抗包被的磁珠^4。所述RNA诱饵与细胞裂解物孵育以允许RNA-蛋白质复合物，其随后被拉下来的磁性支架的形成。更具体地，该RNA下拉协议如下所述使用的RNA片段从AR 3'UTR作为诱饵检索的HuR蛋白质，普遍表达RBP势必的mRNA ^6,7的3'UTR，从theadipocytelysate原代培养。为了测试该测定的结合特异性，非相关RNAas以及空白链霉珠被包括作为对照。此协议是与蛋白质印迹或质谱（MS）兼容，以确认一个特定RBP的捕获或识别捕获的限制性商业惯例，分别为⁸的全剧目。

几种技术可用于研究RNA-蛋白质相互作用秒。揭示通过一个给定的RBP，RIP（RNA免疫沉淀）和CLIP（UV交联和免疫沉淀）结合的RNA可以应用。与此相反，以确定一个给定RNA的蛋白质伙伴，RNA下拉，啁啾（通过RNA纯化染色质分离），图表（RNA靶捕获杂交分析）和RAP（RNA反义纯化）都可以应用。在与后来者相比，RNA下拉技术花费较少的精力来设置。它可以用来捕获蛋白在体外 和体内 。 RNA的下拉，这在技术上是比其体外对应更具挑战性， 在体内的方法，通过在细胞中的交联保留RNA-蛋白质相互作用，捕获的从细胞中感兴趣的适体-标记的RNA，和随后检测结合的限制性商业惯例。 RNA的下拉可以用于充实低丰度限制性商业惯例，并且分离和鉴定在控制细胞调节^9,10具有多样功能作用的RNA-蛋白质复合。

研究方案

注:在本研究的上下文中感兴趣的RNA为AR 3'UTR的片段。

1.生物素标记的RNA的制备

1. 以获得的RNA，使用商业试剂盒和以下生产商的说明¹¹通过PCR扩增T7-AR-低聚，随后通过体外转录。
   注:引物用于PCR列于表4:T7-AR-F和T7-AR-R。
2. 对于非特异性结合控制，通过PCR扩增的萤火虫萤光素酶（FL）的DNA psiCHECK-2的质粒，随后通过体外转录的部分序列。
   注:引物用于PCR列于表4:hluc（+） - T7探针-F和hluc（+） -探针- R 表4模板和引物进行PCR扩增的序列。
3. 对于50微升的PCR反应，混合50纳克DNA（寡核苷酸或质粒），4微升的dNTP（每个人的dNTP为2.5毫米），5微升10X反应缓冲液，1微升2.5 U /＆＃181;微升DNA聚合酶，2微升10μM的正向引物，2微升10μM反向引物，和无核酸酶水。
   1. 使用下列程序运行在热循环仪进行PCR扩增。第1步:95℃2分钟一个循环;第2步:35个循环的95℃30秒，55℃30秒和72℃30秒（AR）或60秒（佛罗里达州）; STEP3:10分钟，72℃的一个周期。
4. 合成使用以下制造商的说明¹¹ 的体外转录试剂盒的生物素化的RNA。在该实验中，使用PCR产物作为用于RNA合成的模板。对于一个20微升的体外转录反应，混合200纳克的PCR扩增的DNA，2微升每个单独的NTP的，1微升10mM的生物素的CTP，2微升10×反应缓冲液，和2μlT7 RNA聚合酶。孵育在37℃下该混合物4小时。
5. 在37＃以下体外转录，用1微升2单位/微升DNA酶治疗反应混合物176℃持续15分钟，以降解模板DNA。最后，稀释生物素化的RNA，以60微升为随后的纯化的总体积。
6. 纯化生物素化的RNA，通过使用以下制造商的说明¹²纯化柱以除去盐和未掺入的核苷酸。测量RNA浓度，并储存于-80℃用于后续的下拉测定。
7. 至在90℃下确保在RNA-蛋白质相互作用，热加入50μl生物素化的RNA（50时）感兴趣的RNA适当的二级结构2分钟，冰浴2分钟，然后用50μl2×RNA结构缓冲液（ 表提供3），并允许将RNA在RT折叠30分钟^13,14。

2. RNA结合的珠的制备

注:使用磁立场的磁珠和上清液分离。

1. 通过简短vorte悬浮在原始小瓶链菌素包被的磁珠兴下列制造商的说明。转移150微升重新悬浮珠子到1.5ml管中。放置在磁体的管1分钟。弃上清。保持珠沉淀。
   注:在RNA Pull-down实验，由原来的小瓶等分悬浮颗粒时，使用的检测之后印迹50微升珠和200微升珠化验后MS。
2. 通过重新悬浮珠粒料用1ml制造商推荐的1×W＆的B（结合和洗涤）缓冲液（ 表3）洗一次珠，随后在旋转器在室温下旋转管5分钟。弃上清。保持珠沉淀。
3. 通过重新悬浮珠粒料用400μl缓冲液A缓冲液A灭活珠上的RNase，洗珠两次，每次是含有0.1M NaOH和0.05 M氯化钠（ 表3）的碱性溶液。旋转管，在室温下在旋转器2分钟。弃上清。保持珠沉淀。
4. 要通过重新悬浮珠粒料用400μl缓冲液B（ 表3），接着在一旋转器在室温下旋转管2分钟从珠除去氢氧化钠，洗珠两次，每次的时间。弃上清。保持珠沉淀。
5. 用300微升2倍W＆B缓冲液重悬珠颗粒，分割珠平等，转移成三个1.5毫升管（每管100微升珠）。供应含珠管100微升核糖核酸酶自由水，100微升生物素化FL RNA和100​​微升生物素化AR 3'UTR RNA，分别为。
6. 孵育各胎圈混合物在室温下用旋转1小时。放置管上的磁铁1分钟。丢弃所有上清。保持珠颗粒。
7. 通过重新悬浮用400μl1×W＆B缓冲液各胎圈粒料洗涤珠两次，每次，随后在一旋转器在室温下旋转管5分钟。
8. 放置管上的磁铁1分钟。丢弃所有上清。重悬每个珠子PELLE吨，50微升核隔离缓冲液（ 表3）。

3.前脂肪细胞的分离和脂肪生成诱导

1. 正如在以前的出版物⁵描述，剖析从肩胛间棕色脂肪垫前脂肪细胞（C57BL6野生型小鼠，3周龄）。
2. 生长并在体外分化前脂肪细胞^5。细胞准备用于分化开始后4-5天的下游应用。

从初级脂肪细胞的细胞裂解物的制备4

注:确保细胞裂解液的制备所有的程序都在冰制成，和所有缓冲区，在冰上冷却。冰上预寒意DOUNCE玻璃均质。

1. 成长并在15 cm的培养皿^5（参见3.2节）区分脂肪前体细胞。每道菜都提供了足够的细胞一个RNA pull-down实验。在第4天或分化，丢弃细胞培养基的第5天，和洗涤策LLS一旦与1X PBS。
2. 收获细胞，加入10-15毫升1×PBS中至细胞，刮去离心200 XG收集在50ml管中的细胞，并沉淀细胞在RT 5分钟。用1毫升吸管弃上清。
3. 在2毫升悬浮细胞沉淀低渗缓冲液（ 表3），并在冰上孵育细胞15分钟。转移细胞到15毫升DOUNCE玻璃匀浆和剪切细胞机械地在冰上用20笔。
4. 沉淀细胞核离心3300 xg离心15分钟，在4℃。保持冰为进一步利用细胞核沉淀（参见4.6节）。转移上清液至1.5毫升管中，添加3M氯化钾到上清液以20,000 xg离心以获得150mM的终浓度，并旋转，在4℃下15分钟。
5. 离心后，小心地用1毫升吸管除去lipidlayeron顶部，并收集上清液作为细胞质细胞裂解物。
6. 重悬细胞核沉淀（见4.4）在1毫升核隔离缓冲。 ŧ转让（BOT）的细胞核用1毫升吸管15毫升DOUNCE玻璃匀浆，并机械上用100笔划冰剪切核。沉淀通过离心核碎片以20,000 xg离心15分钟，在4℃，并收集上清液作为核细胞裂解物。
7. 无论是结合了核和细胞质的细胞裂解物，或单独使用每个分数，下游下拉应用程序。在此演示实验中，细胞裂解物的这两个级分合并以1:1的体积比为1:1。
8. RNase抑制剂添加到该未分级的细胞裂解物，以获得0.5U /微升的最终浓度。抛开100微升细胞裂解液作为免疫印迹¹⁵输入控制。

5.绑定和RBP洗脱

1. 分裂细胞裂解物分成三个等份（在1.5ml管1毫升细胞裂解物），并与空白孵育，佛罗里达的RNA共轭和AR 3'UTR的RNA共轭珠粒（见2.8节），分别为3小时，在4℃ C轮换。
2. 放置管上的磁铁1分钟。使用1毫升吸管，随后RNA分离从上清液来确认RNA的完整性收集上清液。通过使用以下制造商的说明（ 表2）的酸性硫氰酸胍-苯酚溶液分离RNA。通过分析核糖体RNA的28S和18S亚基评估RNA的完整性。保持冰珠颗粒。
3. 通过重新悬浮每个珠子粒料用含有40单位RNA酶抑制剂和0.25％IGEPAL，随后在旋转器在室温下旋转管2分钟1毫升核隔离缓冲器洗涤磁珠六次，每次。对于使用的磁珠和上清液分离磁立场。丢弃所有上清。保持冰珠颗粒。
4. 使用以下步骤，从免疫印迹珠洗脱RNA-蛋白复合物。首先，在悬浮75微升核隔离缓冲每个珠子颗粒;然后，加入25微升4倍免疫印迹装载BUFFER（含有SDS），得到100微升的总体积。最后，在95℃下煮沸此100μl的溶液珠5分钟。
   注意:使用以下步骤，从MS珠洗脱RNA-蛋白复合物。第1步:重悬在100μl洗脱缓冲液（ 表3）每个珠子粒料;第2步:孵育珠样品在室温下用旋转2-3小时; STEP3:离心机，并收集含蛋白质的上清液; STEP4:提交的MS之前集中蛋白质溶液20-30微升。
5. 离心机每100微升珠样品以12,000×g离心30秒，在4℃，并且收集上清液。分装15微升上清免疫印迹分析（见6.1和6.2）。探测用稀释的HuR小鼠单克隆抗体的得到的膜（1:1,000稀释度），过夜。

6.免疫印迹的RBP验证

1. 独立的限制性商业惯例，通过SDS-PAGE使用标准技术。
2. 我们开展通过探测与感兴趣的RNA相关的限制性商业惯例用标准技术船尾印迹。
   注:在这个演示实验中，使用了的HuR蛋白的免疫检测的HuR鼠单克隆抗体。
3. 孵育稀释的HuR抗体所得膜:在5％（1 1000稀释）w / v的脱脂奶粉，1×TBS， 0.1％ 吐温- 20日4 °下缓慢摇动过夜。用1×TBST洗膜三次。在室温下1小时的第二抗体（山羊抗 - 小鼠IgG-HRP）孵育膜。洗膜。制定并记录信号。

结果

在这个演示实验中，AR RNA片段作为诱饵捕捉到它的结合蛋白的HuR。两者FL的RNA诱饵即非相关的HuR蛋白，以及未缀合的链霉空白珠的等分试样用作阴性对照。 RNA-蛋白的相互作用，可能会发生无论是在细胞核或细胞质中，并且此下拉协议可以应用到无论是总或分级（核或细胞质）细胞裂解物。通过Western印迹的蛋白质的分析表明，15微升未分级细胞裂解物的样品（见4.8节），如...

讨论

lncRNAs和限制性商业惯例在健康和疾病的重要角色，但这些分子的分子机制知之甚少。与lncRNA分子相互作用的蛋白的鉴定是朝着阐明的调节机制的关键步骤。通过将RNA下拉测定系统限制性商业惯例的富集是基于在溶液中相互作用的复杂，使得从细胞裂解物蛋白可使用结合于链霉抗磁珠的生物素化的RNA诱饵被选择性地提取的捕获。其他一些方法，如啁啾，图表，RAP可以达到同样的目的，但这些方法?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit	Ambion
Biotin-14-CTP	Invitrogen
NucAway spin columns	Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)	Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)	Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)	HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)	HyClone
RNase inhibitor	Bioline
Protease inhibitor	Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase	Agilent Technologies
TRIsure	Bioline
Name	Company	Catalog Number	Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge	Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge	Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler	Bio-Rad
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24	BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus	Bio-Rad
DynaMag-2 magnet	Life Technologies