快速分子检测和流感病毒A和B的分化

摘要

我们描述了一个快速，分子为基础的甲型和乙型流感检测。流感检测采用等温扩增与流感特异性引物，其次是目标检测与分子信标探针检测15分钟内每一个目标。的甲型和乙型流感检测是用户友好的，并要求最少的动手时间来执行。

摘要

流感是在人中由流感病毒引起A和B的传染性呼吸系统疾病，并导致每年发病率和死亡率的一个显著量。的甲型和乙型流感检测是第一个可用的CLIA-放弃分子快速流感测试。流感A和B的测试工作通过采用等温扩增与流感特异性引物，接着目标检测的分子信标探针。这里，A型流感的性能和B测定冷冻，归档鼻咽拭子（NPS）试样储存在病毒运输介质（VTM）进行比较，以呼吸面板测定。

流感A和B测定的性能通过的结果相比较，以呼吸面板参考方法进行评价。总甲型流感病毒的敏感性为67.5％（95％CI（CI），56.6-78.5），特异性为86.9％（CI，71.0-100）。对于乙型流感病毒的检测，其敏感性和特异性分别为90.2％（CI，68.5-100）和98.8％（CI，68.5-100）表示。

该系统具有的显著缩短测试时间比其他任何现有的分子检测及简单，无吸管程序运行的优势一个完全集成的，封闭的，小尺寸的系统。总体而言，流行性感冒A和B测定本研究评估具有作为一个点 - - 关心快速流感诊断测试的可能性。

引言

流感病毒感染导致发病率和死亡率，每年^1，2，3的显著量。单纯性流感的特点是宪法和呼吸道症状，如发热，肌痛，头痛和非生产性咳嗽^4,5。老年人，幼儿，免疫功能低下患者，和患者的潜在合并症处于严重的并发症，如肺炎，心肌炎，中枢神经系统疾病，甚至导致死亡^6,7风险较高。

流感感染是抗病毒治疗的症状出现后48小时内及时服用能减少疾病的严重程度和长度从⁸其他呼吸道病毒唯一的。流感的快速鉴定也已示出减少使用的不必要的抗生素^9,10。另外，住院患者感染流感病毒必须放置在适当的感染控制预防措施隔离室。然而，所造成的非流感病毒呼吸道疾病可能难以从流感临床区分。出于这个原因，对于流感快速准确的诊断测试是用于临床患者管理非常重要。

数测定法可用于检测和流感病毒鉴定。快速流感抗原检测试验（RIDTs）被广泛应用于临床实践中作为点护理测试，因为它们易于使用，并提供在15至30分钟^11，12的结果;然而，他们的敏感性有很大的不同取决于制造商和人口（10-80％）进行测试，并且流感类型和subtyPE ^{13，14，15。}直接荧光测定（的DFA）提供超过RIDTs优异灵敏度，但处理时间大于（〜3小时），并且必须由熟练的技术人员^16，17来完成。病毒培养一直是流感的诊断的金标准，并已改善了两个RIDTs和DFA的¹⁸灵敏度。然而，流感病毒培养可以从2-14ð任何地方来完成，减少在帮助病人管理¹⁹其效用。最后，核酸扩增试验（NAAT）已经取代培养技术在流感诊断新的金标准。 NAAT被认为具有在几个小时检测流感的最大灵敏度。然而，NAAT是最昂贵的测定和需要专门的设备和技术来执行^{5 >，20，21，22，23，24，25。}

此处所描述的流感A和B的测定法是第一CLIA-放弃分子快速流感测试是容易获得的。此法的工作原理是采用使用特定流感引物，其次是目标检测与分子信标探针等温扩增核酸内切酶泥炭截短扩增反应（NEAR）。该测定区分流感A选自B，需要2分钟来设置和处理一个样品，并且总共需要15分钟来完成。

这里，我们目前的流感A＆B试验的协议。此外，我们还提供了一个样本数据集比较流感A对已归档的鼻咽拭子（NPS）的性能和B检测标本保存在病毒的传输介质（VTM）到其他呼吸道病原体面板检测。

研究方案

道德守则:使用遗留临床标本被批准，并遵循纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心伦理审查委员会的指导方针。

1.在运行分析

注:甲型和乙型流感检测已被批准用于鼻咽拭子标本和存储在病毒的传输介质鼻咽拭子。拭子被包括在试剂盒中，并应被用于最佳性能。然而，人造丝，泡沫，植绒拭子或聚酯鼻拭子也可用于收集鼻拭子样品。

1. 收集鼻拭子样本，将拭子插入具有最明显的排水或者说是最拥挤的鼻孔。轻轻旋转，推拭子插入鼻孔，直至遇到阻力，并从鼻孔慢慢取出之前将针对鼻壁几次。存放拭子和装有3毫升病毒的传输介质（VTM）的小瓶运输他们。
   注意:仔细注意appropr莱特标本采集必须被视为标本采集不足可能会产生错误的结果。
   注意:拭子标本采集后尽早进行测试。然而，它们可在室温下保存长达2小时或在2-8℃下进行长达24小时的冷冻如果测试不是立即可用。新鲜采集的标本是理想的最佳测试性能。不当的样品处理，储存和/或运输可能产生错误的结果。
   注:作为预防措施，执行此测试人员应该把所有的标本都当成潜在通过处理标本时注意以下事项普遍预防感染。
2. 将所有样品至室温测试之前。
   注:所有的测试部件仅用于单次使用并且不应当被用来执行多个测试。不要混用不同批号试剂盒成分。不要使用试剂盒过去的到期日期。
3. 把蓝色样品接收器ROO测试前m温度。橙色测试碱可以无需加热到室温进行试验。
4. 留在箔包裹所有试验片直到即将使用前。通过按下仪器侧面的电源键打开仪器。输入用户ID，然后按"确定"。

2.运行测试

1. 开始测试过程中，触摸"运行测试"在仪器屏幕上。通过屏幕上的键盘或条形码扫描仪，然后按Enter病人ID"确定"。打开盖子，然后插入橙色试验基地到橙色试验基地持有者。
2. 确认正确的测试显示屏幕，按下"确定"。将蓝色样品接收器插入蓝色样品接收机持有者。
   注:在仪器放置，因为这将防止到达正确的工作温度下的洗脱缓冲液并可能影响考试成绩之前，不要打开示例接收器。
3. 等待样品接收器预热。当仪器提示，去掉铝箔封口，然后将病人拭子被测试到样品接收器。
   注:当删除箔，将两个手指放在样品接收器的边缘，以确保它留在地方。
4. 大力混在液体中的棉签，持续10秒，按压棉签头靠在一侧的样品接收器，你混吧，帮助逐出拭子标本。按"确定"继续。如果存储在病毒的传输介质测试拭子，涡VTM，持续10秒，然后加入200μl的样品接收器。
5. 按白转移盒插入蓝色的样品接收器。继续按在样品接收，直到橙色指示灯上升。
6. 抬起，然后转送盒连接到测试基地。观察橙色指示灯下降，一旦盒传输连接正确。盖上盖子，不开，直到"测试完成"屏幕上显示的消息。

3.质量控制

1. 触摸"运行QC测试"在主屏幕上。选择QC测试中运行。确认测试类型通过触摸"OK"，然后按照屏幕上的提示完成测试，用于测试的QC样品不一致。

4.结果解释

1. 试运行结束后，观察与解释流感A，B，未知亚型的出现在屏幕上显示的测试结果。对于无效结果重复测试。

5.保养和清洁

1. 清洁仪器和周围长凳用70％乙醇或10％的漂白剂溶液每日区域。喷在湿润的无绒布擦拭清洗液。不要在仪器上直接倒入解决方案。

结果

在这项研究中，归档NPS标本采自2013年NPS标本在3毫升住院患者提交2012年12月15日和3月1日之间的流感爆发期间与纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心（MSKCC）流感样症状的收集VTM，并与检测呼吸道病毒（RP），其中包括流行性感冒A，A-1，A-3，和B小组在研究期间的分子检测常规的临床实践的一部分进行测试，3675 ​​NPS标本提交到MSKCC临床实验室进行检测。这些标本，45，425，37，77的药...

讨论

流感病毒是发病率和死亡率的显著世界范围的原因。流感的快速和准确的诊断是主要键期间呼吸季节管理流感爆发中的一个。其他基于抗原的测试是快速和容易执行;然而，它们具有低的灵敏度^13。另一方面，传统的分子测试具有改善的敏感性，但需要更多的有经验的化验师来执行，而且更昂贵。在这项研究中和协议中描述的流感A和B测定是流感A和B的CLIA-放弃，快速的分子测试的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alere i Instrument	Alere	NAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test Kit	Alere	425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode Scanner	Alere	EQ001001
Alere Universal Printer	Alere	55115 (Global), alereiprinter (US)
200 µl precision pipette
200 µl disposable pipette tips
Viral transport medium	Remel	M4-RT