新对象的探索在小鼠电位测定高阶重复的行为

摘要

Higher order restricted, repetitive behaviors (RRBs) disrupt the lives of affected individuals. These behaviors are challenging to model in rodents, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for RRBs difficult. Here we describe novel object exploration as a potential assay for higher order RRBs in mice.

摘要

Restricted, repetitive behaviors (RRBs) are a core feature of autism spectrum disorder (ASD) and disrupt the lives of affected individuals. RRBs are commonly split into lower-order and higher-order components, with lower order RRBs consisting of motor stereotypies and higher order RRBs consisting of perseverative and sequencing behaviors. Higher order RRBs are challenging to model in mice. Current assays for RRBs in mice focus primarily on the lower order components, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for higher-order RRBs difficult. Here we describe a new assay, novel object exploration. This assay uses a basic open-field arena with four novel objects placed around the perimeter. The test mouse is allowed to freely explore the arena and the order in which the mouse investigates the novel objects is recorded. From these data, patterned sequences of exploration can be identified, as can the most preferred object for each mouse. The representative data shared here and past results using the novel object exploration assay illustrate that inbred mouse strains do demonstrate different behavior in this assay and that strains with elevated lower order RRBs also show elevated patterned behavior. As such, the novel object exploration assay appears to possess good face validity for higher order RRBs in humans and may be a valuable assay for future studies investigating novel therapeutics for ASD.

引言

自闭症谱系障碍（ASD）是一个由三个核心症状的神经发育障碍:社会障碍，难以通过语言沟通，和重复图案的行为^1。自2000年以来，谁被诊断患有自闭症的个体数从1 150十年²跨度提高到1 68。虽然该病症的发生率不断增加，这种疾病的原因尚不清楚。目前已在努力确定的核心和ASD的相关症状适当的鼠标模型，这些模型可能会导致ASD的基本症状和原因的认识增加上升。有迹象表明，似乎显示与表面效度的行为ASD的核心症状，包括重复的行为³多个近交系小鼠品系。

限定，重复的行为（RRBs）是一些精神障碍，例如ASD的核心症状。RRBs可以与病症⁴的严重性增加，并且可以极大地破坏受影响的个体的生活方式。 RRBs通常分为两类，低阶重复行为，其在人类中包括诸如摆动和手拍打行动;和高阶重复行为，其由严格遵守的常规和电阻变化^5-8。

低阶重复行为已被广泛研究中，他们表现为运动癖，其可在实验室设置⁹容易地观察到啮齿动物。这些行为似乎在人类的好脸色有效性RRBs，和巨大潜力的构想效度，以及^10。对于低阶RRBs的存在测试可以通过鼠标活动的视频监控完成，以研究这些电机的刻板¹¹的较量和持续时间。高阶重复的行为姿势基础生物医学重新挑战利用搜索啮齿动物，因为这些RRBs不是通过简单的观察是很容易识别。由于在确定这些行为困难，存在高阶重复行为更少建立测定。传统上，高阶RRBs已经在使用迷津，其中试验动物被训练逃脱到达能力啮齿动物进行测量。然后逃逸位置被切换和重新学习的逃逸位置所需试验次数被记录^12。这些测定法是不理想的，因为它们需要一个长的训练周期，经常诱发焦虑，并可能导致高度可变的结果。空穴板勘探也被用来量化高阶RRBs ^13,14。这种方法不需要延长培训课程，但依靠食物的动机和/或嗅觉辨别。试验高阶RRBs是不引起焦虑或者需要训练将是一个很好的补充洞板勘查现有剧目 n和目前使用的基于迷宫的测定法。

在C58 / J（C58）近交系小鼠强烈体现了高水平的房间隔缺损，即重复，无目的刻板电机和自我疏导^3,11水平升高相关的刻板行为。此外，C58小鼠显示通过高水平的饲养，背翻转和摸索^11,14,16的RRBs。该菌株开始在新生儿期早期显示这些行为，并继续整个成年期显示出来。这将是理想的，以便能够测试对于高阶升高RRBs的存在下，以补充存在于该菌株中以及其它小鼠品系的证据充分的低阶RRBs。这里所描述的新颖的对象勘探测定为研究人员提供能够同时观察低阶和高阶RRBs，因为它给测量图案化的行为以及重复电动机的刻板的能力的机会。

e_content">使用新物体勘探作为高阶重复行为的测定通过Pearson 等人开发的^。17，这新的评估是行之有效的旷场试验^18-21中，并添加四种新型的对象到扩展舞台。小鼠允许自由调查这些陌生的对象的数量和对象的调查的顺序被跟踪然后，进行了分析模式的存在的对象的调查，以显示所述对象之间的图案化的调查升高号码BTBR小鼠。使用该测定中，小鼠可以在无需学习行为以及去除不必要的刺激显示高阶重复并构图的行为。小说对象勘探诱导高阶RRBs，因为它允许将小鼠通过其天然勘探创建图案和形式的序列。使用该测定允许研究者量化这些高阶RRBs的存在。

Pearson 等人 。开发了这个实验，并用它来 ​​测试潜在的高阶重复的行为在BTBR近交系小鼠的存在，用有趣的结果^17。我们最近发表的后续研究看C58，C57BL / 6J（C57）和FVB /新泽西州（FVB）菌株的行为，以及更详细的调查潜在混杂变量存在于该测定中，以及可能的统计方法分析数据生成^22。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

这里描述的协议在雷德兰兹大学被批准的机构动物护理和使用委员会。在这些研究中所用的C58，C57和FVB小鼠最初是从杰克逊实验室（巴尔港，ME）获得现货雷德兰兹大学生态饲养场饲养。从该动物饲养哨兵被每六个月筛选，结果为无病原体。

1.设备和房间设置

注意:我们用于新物体的测试两个不同的舞台:一个透明的塑料矩形保持架（45厘米×为24厘米×20cm）上或为41厘米的底部直径的不透明圆笼;然而，可以使用任何笼。 Pearson等人在他们的实验中使用的更小的矩形笼（20厘米×30厘米×20厘米）。从这个特定的实验设计细节包括以下，但考虑到该测定的新颖性，有行为表型的任何描述的变量的视野内不接受的标准。

填充测试竞技场约1/2的玉米芯床上用品。
1. 选择四种不同的新对象。选择四个对象即具有大致相同的尺寸，高密度的塑料制成，以方便清洁和在形状与颜色彼此抗蚀咀嚼和不同。重要的是，保证测试的小鼠不暴露于这些对象直至在测定中运行。
   注:例如，一个粉红色的积木，红色猴子，白色的瓷砖，蓝色的写作和标准的白模在这里使用。
2. 在长方形的舞台上，将这些对象从角落约3厘米。在圆的舞台上，放置物体，使得它们在彼此相等的距离和从两侧约10厘米。记录每个对象的位置为不同的号码，1-4（ 图1）。确保对象被放置在一个随机或平衡顺序在整个测试。
3. 相机直接测试上述立场竞技场在适应和实验阶段记录整个舞台。
   注意:有研究者在同一个房间的老鼠测试期间可能会影响活动水平和探索。

2.新对象的探索试验

1. 试验在与荧光灯照明的房间的光周期开始时在约100勒克司。确保灯具是整个测试领域的统一，规范的外观，而视频录制。
2. 将已知尺寸的notecard在测试舞台的底部，并开始录像。
3. 传输测试鼠标到一个空的测试舞台10分钟以用作驯化期。视频记录的适应期。
4. 适应期后，离开了鼠标在舞台上，很快这四个新对象添加到测试舞台并记录鼠标行为额外10分钟。
5. 一旦整整20分钟驯化/ PE测试荒漠化问题已经结束，返回测试鼠标到其家乡笼彻底清洁和干燥小说对象和测试竞技场无味洗洁精和水。

3.视频评分

1. 利用视频，方便可靠完成所有行为评分。
   注意:行为记录软件Noldus观察员用于执行此处描述的步骤^22，而是一个专门程序不是必要的:
   1. 以得分第一视频前，设置项目通过创建一个新的项目或编辑现有的，类似的项目编码行为记录软件方案。
      1. 在项目设置中，设置数据采集为"脱机观察。"内的行为编码框，节目"拼字游戏"，"挖"，"饲养"，"美容"和"嗅对象1，2，3和4"作为"状态事件"。节目"跳"作为一个'点事件"。注:定义S表示这些行为进行了详细的别处¹¹说明。
         注:国活动有开始和停止时间，而Point事件只是收集计数数据。每个离散的行为的击键是由软件生成的，这些对应击键编程到一个次级键盘（步骤3.1.2）。
      2. 要编程辅助键盘，打开键盘软件，点击屏幕上的显示在相应的按键组合相应的辅助键盘按键，类型，然后单击确定。一旦次级键盘已被编程，关闭软件作为程序将在计算机的后台运行。
   2. 一旦该项目，并已成立，使用行为记录软件进球数和后轮的持续时间（定义为两个前爪被放置在舞台上的墙），刨（定义为老鼠钻入的两只前爪竞技场的床上用品），自新郎（定义为第m乌斯舔自己的身体和/或鼠标摸脸与他们的前爪的任何部分）的任何区域，和跳跃（定义为小鼠饲养，然后跳跃，使所有四个脚离开地面同时地）。
      1. 要进球的视频，转到文件>打开项目，然后观察>观察>新建。该程序会提示输入一个文件名。一旦命名，选择相应的视频媒体文件。
      2. 通过点击开始按钮，观察开始得分。
         注意:当得分小鼠重复的行为，所有国​​家活动需要两次击键，第一对应的行为的开始和所述第二相对应的行为的末尾。点事件只需要一个按键。
   3. 得分的倍鼠标嗅探每个对象的数目。嗅探被定义为任何时间的小鼠在0.5厘米对象的移动它的鼻子。在repet以同样的方式使用行为记录软件测量嗅时间可持续的竞争行为的持续时间进行测定（步骤3.1.2）。
      1. 每次鼠标嗅探一个对象，记录相应的位置编号，这将是由10分钟的测试期间（ 例如 1243421 ...）的端部导致的一串数字。手动记录这些数据。
         注:为便于效率和一致性，同时进球的视频，数字总是对应于一个给定的位置，而不是反对。
      2. 如果一只老鼠嗅着一个对象，看着远处，然后再嗅着对象，算上这一数字的两倍。
      3. 一旦完整的10分钟视频已经被拿下，通过点击分析>行为分析>新建可视化数据。一旦数据出现在屏幕上，导出或复制并粘贴到一个单独的电子表格。
   4. 记录的总距离鼠标在测试过程中走过的舞台上。
      注:视频跟踪软件，校准跟踪测试鼠标和记录厘米移动的总距离，使用执行此步骤。通过视频跟踪软件拿下所有视频已在视频的开头放置在舞台上已知尺寸的notecard。
      1. 使用notecard通过设置沿notecard各端的校准线和输入软件的校准屏幕中的适当的长度，以在软件中的每个视频校准。一旦线绘制，输入的已知长度和对应于每行的notecard的宽度。
      2. 在竞技场设置，选择整个舞台。
         注:竞技场不同的区域可以在软件加以区分如果， 例如 ，沿着墙壁与通过中心移动鼠标是兴趣。
      3. 在试验控制设置，选择一个十分钟的时间。在检测设置，选择在浅色背景上一个黑暗的物体。
         注意:此需要，如果正在使用白化小鼠被改变，或者如果背景是暗的阴影。
      4. 一旦设置已被编程，进球视频。点击采集>打开采集。在采集控制中，单击新建试用，然后开始试用。 10分钟已经过去之后，该程序停止，数据可以被可视化。
      5. 单击分析>计算统计数据。一旦数据出现在屏幕上，导出或复制并粘贴到一个单独的电子表格。

4.统计分析，测序

1. 内的相应对象由每只小鼠产生调查数字串，确定没有重复数的所有可能的3位的组合（ 例如 121，123，124，但没有112或122）的总数。
   注意:写在Python编程语言编写的程序被用来确定每一个可能的序列似乎数字串中的次数。它不必使用外部程序，并且此步骤可完成许多不同的方式（ 例如 ，使用一个查找Microsoft Word或Excel函数）。
2. 记录的时间顺序每次发生的数量，并确定每只小鼠的三个最经常重复的序列。
   注意:个别序列将通过鼠标变化，并且实际的序列比次重复的序列数较少的兴趣（ 即粘附到图案比图案本身更重要）的。
3. 因为序列的总数的小鼠重复将正相关于活动水平，通过图案为每个单独的小鼠的总数除以最频繁模式的量修正这些值。这将产生一个重复序列索引，是独立的整体活动。
4. 比较次数各小鼠重复其最常见的序列组之间使用适当的方差分析，多重比较方法（Dunnett检验，对例如 ）和事后测试的数量（对于活性水平修正）。

5。统计分析，对象偏好

1. 使用上述（步骤3.1.3.1）产生相同的数字串，通过计数的总次数确定每只小鼠的新物体偏爱每个对象进行了调查，或者换句话说，计数1秒的总数量，2秒，3秒，和数据串中4秒。正确的活动水平，并通过方差分析比较上述（步骤4.3-4.4）。
   注意:这些方法通过我们的实验室²²公布，并说明这里有很大程度上基于Pearson 等^[17]。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

代表性数据²²显示，雌性C58 / J小鼠显示更多数目比在圆形竞技场的其它菌株测序图案（ 图2，A组 ），但不是在矩形竞技场（ 图2，图C）。无彼此（ 图2，图B和D）的不同的三雄菌株。该代表的数据显示，男性和女性C58 / J小鼠显示他们的参观人数最多的对象更强烈的偏爱（随后，他们至少访问对象的低偏好）在本轮主场（

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

在这里，我们提出了一个新近开发的分析，可能是与表面效度量化鼠标行为在人类高阶重复的行为非常有用。不同于像巴恩斯或T型迷宫更成熟的试验，这种新的对象探索试验并不需要任何鼠标的训练也不是特别焦虑发人深省。此外，新的物体勘探不需要任何食物或社会刺激，从而允许更专注于感兴趣，RRBs行为，并减少混淆变量倾斜的结果的可能性。此外，不同品系小鼠做证明在该试验中不同行?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice
Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter)	United States Plastic Corp.	13931	Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice
Standard Corn-Cob Rodent Bedding
Novel Object - red monkey	Hasbro, Pawtucket RI		from Barrel of Monkeys
Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO
Novel Object - tile	Thinkfun Inc., Alexandria VA		from Toot and Otto
Novel Object - standard white die
Video Camera
Behavioral Logging Software - The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
Video Tracking Software - EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
X-Keys input keyboard	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI