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摘要

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

摘要

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

引言

的当前的HIV-1治疗的局限性在于，它们必须长期施用，以防止疾病的进展。 HIV-1的抗T淋巴细胞，或造血干细胞的移植，有可能提供HIV-1复制的长期控制在没有药物治疗1,2的电位，也可以是实现一种HIV-1治疗的有效方法3。渲染到HIV-1复制抗性细胞的一种方法是自体移植4中插入一个或多个基因编码抗-HIV-1的RNA或肽进入受感染个体的细胞。几个候选抗HIV-1基因已被设计有一些进入临床试验在两个5或3个6的组合，以防止HIV-1的抗性的发展的任何单一基因。

抗HIV-1 RNA的顶端候选组合的基因治疗中，由于它们的低电势以引起免疫反应和，因为它们从很短的基因序列转录。一些抗HIV-1的RNA已被设计为靶向病毒进入和整合。然而，大多数的抗HIV-1的RNA靶向病毒生命周期积分后步骤（ 图1）。后的整合酶抑制剂包括诱饵的RNA，针对HIV-1调控蛋白达或REV 1，和基于反义RNA的，在HIV-1 RNA针对不同的网站，如核酶7，8的shRNA的U1i和RNA的9。已用于比较的抗HIV-1 RNA的功效的方法包括监测病毒复制与编码基因候选RNA和测定用表达候选RNA的质粒瞬时转染细胞的病毒的生产和HIV-1的表达质粒转染细胞10 -13。我们先前使用过的HIV-1的生产试验，筛选新的核酶靶位点13-15 HIV-1 RNA。这些方法，至今已细化到优化的RNA的格式干扰分子从质粒DNA表达为一个shRNA的或作为合成的siRNA 16传递。该测定测量生产的人胚胎肾（HEK）293T细胞成熟的病毒，并且可以用于比较针对在HIV-1复制周期积分后步骤（ 图1）抑制剂的影响。对于面向预集成的步骤抑制剂，需要替代的试验，如TZM-BL细胞感染性测定17来评价抗病毒疗效。

在临床的抗HIV-1 RNA的递送主要的安全问题包括对人类RNA或蛋白质，以及天然免疫传感器的激活潜在的脱靶效应。为了评估抗HIV-1 siRNA的毒性，我们使用在不同的细胞系16的细胞活力测定。我们还测量了双链RNA的免疫传感器的激活，RNA活化蛋白激酶R（PKR）和Toll样受体3（TLR3），以及移干扰素的PRESSION刺激基因，ADAR1 P150。这些测定可用于证实抗HIV-1 RNA的效力不因对细胞活力或免疫传感器活化间接影响。他们也是不包括候选人的RNA与进一步发展的潜在的毒性非常有用。

在下面的协议，过程，以确定新的治疗RNA和优化现有的格式被描述。该方法可用于HIV-1复制的筛选基于RNA后整合抑制剂和可适于筛选其他集成后抑制剂如小分子靶向启介导的病毒RNA 18或CRISPR的出口/设计CAS大全MSDS系统到目标集成HIV-1 DNA 19。

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研究方案

1.细胞转染与

  1. 培养的HEK 293T细胞在Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）中补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素。制备在细胞培养基中的2×10 5个细胞/ ml悬浮液。加500，100和1000微升的细胞悬液以每孔24孔，96孔和12孔板，用于病毒生产，细胞生存力和免疫激活测定法，分别为（ 图2A）。
  2. 轻轻摇动平板，用5％的CO 2孵育他们O / N在37℃。生长细胞50-70％汇合。
  3. 根据计划，转染，在1.5ml微管（例如， 图2B）准备测试的RNA及其控制的稀释液。
    1. 对于病毒生成测定，准备HIV-1表达质粒的10纳克/微升稀释并加入10微升至每管。下一个准备测试RNA的5微米稀释和阴性对照RNA.添加2.5或10微升各试验RNA和阴性对照稀释到相应管25或100nM的最终浓度。
    2. 对于细胞存活力测定法，制备试验RNA的5微米稀释和10毫克/毫升稀释的阳性对照RNA，低分子量聚I的:C。添加2微升试验RNA或阳性对照RNA稀释至用于分别100nM或200微克/毫升的最终浓度，相应的管中。
    3. 对于免疫激活法，加入20微升试验RNA或步骤1.3.2准备阳性对照RNA稀释。为分别100nM或200微克/毫升的最终浓度，相应的管中。
      注意:对于测试RNA表达质粒，在地方试验RNA的5μM稀释准备10毫微克/微升稀释液，给25和100最终金额纳克步1.3.1。和100纳克的步骤1.3.2。 1.3.3和。
  4. 添加50，25或75微升的DMEM为病毒督促各转管，减税，细胞活力和免疫激活测定，分别。用于病毒生产测定，带来细胞和制备转染管到生物安全水平3（BSL3）实验室下一步骤之前。
  5. 添加2微升转染试剂依次向转染管和孵育15至20分钟以使配合物形成。见材料的表的具体的转染试剂中使用。
  6. 从每个微管逐滴向在细胞培养板中的相应位置添加整个转染混合物。轻轻摇动并在37℃用5％CO 2孵育48小时将板。
  7. 测量在细胞培养板（ 图2C）的HIV-1的生产（第2部分），细胞存活率（第3节）和免疫激活（第4节）。

2.病毒生成测定

  1. 除去从培养箱24孔细胞培养板，并轻轻摇动BSL3细胞培养内板引擎盖。转移150微升上清液从每孔在96孔平底板，这将被用于量化的HIV-1的生产相应的井。
    注意:普通的病毒定量测定包括测定HIV-1的衣壳蛋白（p24的）通过酶联免疫吸附测定（ELISA）20，量化通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）21病毒RNA的表达，并测量活性的HIV-1逆转录酶。步骤2.2至2.5解释的方法来量化HIV-1 RT活性13,15,16。
  2. 转印5微升上清液在一个96孔板的相应孔，含有25微升的病毒破坏鸡尾酒15（ 表1）。在室温下孵育5分钟该混合物，将板转移到放射性工作站。
    注:步骤2.2。只有必要的，如果一个放射性工作站不在BSL3实验室提供。如果板不需要从除去BSL3实验室，继续执行步骤2.3。和到位的25微升放射性鸡尾酒的加入50微升放射性/病毒破坏的鸡尾酒（ 表1）。
  3. 制备放射性鸡尾酒15（ 表1），并添加25微升病毒上清和破坏鸡尾酒的每个孔中。孵育所述板在37℃下2小时。
  4. 点5微升中的玻璃纤维二乙基氨基乙基（DEAE）滤纸纸，将反应混合物到相应的平方和允许斑点干燥10分钟。现货每隔广场反应混合物中，以便没有两个样品直接房客彼此。这有助于在步骤2.6确定每分钟计数（CPM），以避免样品之间交叉。
  5. 洗纸5倍5分钟用2×盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液（ 表1），随后是两个1分钟洗涤用95％的乙醇。允许论文干，封住他们的样品袋。
  6. 剪辑取样袋合作ntaining的纸滤纸成磁带，将磁带插入微板闪烁计数器。设置计数器读取的cpm为32磷与设置在实验中使用的批次[32 P] dTTP各基准日期。选择使用板地图读取和启动计数器进行采样。
  7. 为任何病毒定量方法中，通过相邻的阴性对照划分为每个测试的RNA得到的值再乘以100这个值来得到的HIV-1生产的抑制百分率的测试RNA的每个重复。比较不同浓度不同的测试的RNA的结果的一个例子在图3中提供。

3.细胞活力检测

  1. 从培养箱中取出96孔板，并添加20微升5mg / ml的MTT（3- [4.5二甲基-2-噻唑基] -2,5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物）的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水稀释（ DPBS）到每个孔中。孵育板˚F或在37℃下3小时。
  2. 添加150微升酸化异丙醇与去污剂（1％NP-40，4毫HCl的异丙醇）至各孔，孵育所述板在室温2小时。
  3. 确定在微孔板分光光度计570nm处的吸光度。
  4. 除以由相邻的转染控制每个采样得到的值计算每个阳性对照，检测RNA相对MTT代谢。比较不同测试RNA和阳性对照结果的一个例子在图4中提供。

4.免疫活化分析

  1. 从培养箱中取出12孔板并吸出培养基。轻轻用DPBS洗涤细胞两次，并添加70微升的冷裂解缓冲液22（包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂， 表1）向每个孔中。孵育在冰上10分钟的板。
  2. 转移细胞裂解液微管浸入快速冻结他们管在液氮中。允许样品解冻，并重复2更冻融循环，共3。
  3. 离心15分钟的裂解物在4℃，15700 XG，以沉淀细胞碎片。将上清转移到新的微管中，并确定使用考马斯蓝（布拉德福德）方法23,24蛋白质浓度。
  4. 解决75微克蛋白的从每个样品在10％变性聚丙烯酰胺凝胶并转移到硝酸纤维素膜上如前所述25,26。
  5. 以下电泳并转移到膜上，通过丽春红S（ 表1）为1分钟，随后在双蒸馏水洗涤孵育膜揭示蛋白质带。使用带和蛋白质梯作为指导，在80和55 kDa的切割膜。
    注意:在步骤4.4的样品可以在16×18 CM短运行2凝胶至34 kDa的，所以，它很容易在规定的位置上切割膜，并通过不切感兴趣的乐队。可替代地，多个凝胶可以用相同的样品来运行，以避免切割膜。
  6. 洗出用含有0.05％吐温20（TBST， 表1）的Tris缓冲盐水的Ponceau S染色。添加TBST用5％无脂牛奶以完全覆盖膜。孵育在RT膜搅拌1小时。
  7. 孵育膜O / N在TBST用3％牛血清白蛋白（BSA）和抗体在1000稀释到1对ADAR1（110和150 kDa的），磷酸PKR（62 kDa的），和磷酸化IRF3（47 kDa的），用于分别的顶部，中部和底部片膜。
  8. 洗涤该膜5倍5分钟用TBST和在TBST用5％无脂奶和过氧化物酶标记的山羊抗兔次级抗体（在5000稀释到1）1小时孵育。
  9. 洗涤该膜5×5分钟用TBST和应用电化学发光（ECL）溶液可视化上，根据制造商的说明电影的频带。
  10. 可视化上薄膜的蛋白质条带后，洗膜的中部和底部件10分钟与抗体反萃液。孵育针对总PKR膜O / N在TBST用3％BSA和抗体（在500 1）和IRF3（在1000 1），用于分别的中部和底部件。重复步骤4.8。和4.9。使用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠代替用于PKR膜（中）的抗 - 兔二级抗体。
  11. 洗底部片膜5倍的5分钟用TBST和用抗肌动蛋白的抗体（在5000稀释到1）孵育，用3％BSA的TBST将膜1小时。重复步骤4.8。和4.9。使用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠代替抗兔二级抗体。比较不同测试RNA和阳性对照结果的一个例子在图5中提供。参见材料的表中使用的特异性抗体。

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结果

的程序的一般示意性示出在图2中为三个测试RNA和在图2B中提供了一个对照RNA的一例的转染方案。用于病毒生产和细胞生存力测定法，所读出的每个测试构建体是标准化为阴性对照。重复转染在集，使得每个测试RNA被归一化到其相邻的阴性对照。这样做是为了避免与配位和转染之间的时间，这可能会导致如果，例如，所有的阴性对照的是第一转染不...

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讨论

用HEK293T细胞（ 图2）进行描述的HIV-1的生产法和类似用于筛选HIV-1RNA有效核酶13，shRNA的10,29，siRNA的30，和U1i的RNA 11,31靶位点测定。使用不同的方法来量化的HIV-1的生产，大多数研究已经测量的病毒生产48小时与候选的RNA的HIV-1的表达质粒共转染之后。继生产HIV-1的，不成熟的病毒粒子经历的多聚蛋白的蛋白裂解由HIV-1蛋白酶变得成熟的病毒粒子，能够感染...

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披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

这里介绍的工作是由卫生研究院（CIHR）加拿大研究院的支持（授予DCB-120266，PPP-133377和HBF-348967到AG）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM HyCloneGE HealthcareSH30243.01
FBS HyCloneGE HealthcareSH30396.03
Penicillin/Streptomycin GibcoThermo Fisher15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.Corning353075, 353047, 353043
Micro tubes AxygenCorning311-08-051
Low molecular weight Poly I:CInvivoGen3182-29-6
DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1MirusMIR 2300transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40)USB19628
[32P]dTTPPerkin ElmerBLU505H
poly(A) RNA template Sigma-Aldrich10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primerThermo Fisher18418-012
DEAE filtermat paper Perkin Elmer1450-522
Microplate scintillation counterPerkin Elmer1450-024
MTTSigma-AldrichM-2128
DPBS HyCloneGE HealthcareSH30028.02
Microplate spectrophotometerBio-rad1706930
Lysis buffer tabletsRoche4693159001, 4906837001protease and phosphatase inhibitors
MicrocentrifugeEppendorf5415R
Bradford reagentBio-rad500-0006
Gel running chamberHoeferSE600
Semi-dry transfer cellBio-rad1703940
Protein ladder EZ-RunThermo FisherBP3603-500
Nitrocellulose membraneBio-rad162-0094
BSASigma-AldrichA9647-1006
Antibody stripping solutionMillipore2504
ECL - PierceThermo Fisher PI32106
ADAR1 antibodyfrom Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibodyAbcamab32036
phospho-S396-IRF3 antibodyCell Signaling4947
PKR antibodyfrom Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibodyCell Signaling11904
Actin antibodyMilliporeMAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbitKPL474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouseKPL474-1806
Ponceau S Sigma-Aldrich6226-79-5

参考文献

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