从血细胞使用仙台病毒和离心诱导多能干细胞代

摘要

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

摘要

最近的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）的发展证明，成熟的体细胞可以返回到未分化，多能状态。角质形成细胞，尿细胞，成纤维等早期实验一般用真皮成纤维细胞进行:现在，重新编程各种类型成年体细胞进行。然而，这需要侵入性手术，以获得从病人的成纤维细胞。因此，悬浮细胞，例如血液和尿液细胞，分别因为得到原代细胞的方便的认为是理想的重新编程。这里，我们报告从外周血单核细胞（PBMC）对的iPSC产生一个有效的协议。通过串联电镀转导的PBMC到一个新的，包衣基质使用板离心，该协议可以很容易地提供的iPSC集落。这种方法也适用于脐带血单核细胞（CBMCs）。这项研究提出了一个简单而有效的PROTocol的外周血单个核细胞和CBMCs的重新编程。

引言

干细胞一直是最有吸引力的材料在临床治疗在过去几十年¹中的一个。干细胞的吸引人的特性是多能性和能力的自我更新。在1981年，第一个胚胎干细胞（ESCs）从小鼠胚胎²隔离。然而，当该技术被应用到人的胚胎，它面临几个伦理问题。

在2006年，当山博士和他的团队重新编程小鼠体细胞第一多能细胞，干细胞领域恢复了可能性和兴趣再次被点燃^3。通过提供几个限定的因素，多能干细胞成功地从成年体细胞"诱导"，并由此命名为"诱导多能干细胞（iPS细胞）。"在2007年，该技术被应用到人类细胞^4，得到具有胚胎干细胞的确切特征的细胞，但没有伦理争论。从理论上讲，IPS铯可以从任何个体或患者获得的任何细胞类型中产生。患者特异性iPSCs的上升作为能够模拟疾病表型和每个个体患者的后生条件的潜在工具。使用基因的编辑或可逆转的致病条件的其它方法，患者专用的iPSC也可在个性化用药^5中使用。此外，iPS细胞较少与免疫排斥反应相关的，因为他们有相同的免疫标识作为供体，使得自动移植更为可行^6。因此，iPSCs的已成为疾病建模，药物筛选，并再生疗法的最有希望的平台。考虑到这些好处，改善了协议，可以从最小的细胞来源给予纯净和较高的收益率在最短的时间内量都在不断发展之中。发现为将来应用的最有效的协议中的一个重要的考虑是主要的细胞类型。大多数早期的iPSC产生的原COLS是为贴壁细胞，因为原来的iPSC系从皮肤成纤维细胞诱导⁴优化。然而，这些细胞的分离和制备是劳动密集型的。此外，皮肤成纤维细胞的隔离包括微创手术过程，可以成为更广泛应用的一大缺憾。

因此，对于进一步使用的iPSC的，则需要用采集方便的细胞来源。由于它是通过一个相当微创手术^7-9获得的血液被视为理想的细胞来源。在这项研究中，我们开发了一个简单的修改协议产生外周血单个核细胞（PBMC）iPS细胞。没有特定的细胞类型，例如CD34 +细胞的困难扩张过程中，全血细胞或外周血单个核细胞中连续通过离心用含有山因子的仙台病毒转导之后镀上涂覆基质的平板。这种方法减少了所需的时间转导的漂浮细胞的附着和重编程的细胞是不能够自己附加的损失减少。

研究方案

伦理学声明:本研究方案被批准由韩国天主教大学（KC12TISI0861）的机构审查委员会。

1.血单核细胞的分离

1. 单核细胞的分离（-5天）
   1. 从在细胞制备管（CPT）抽血获得至少10毫升新鲜血液。
   2. 血液转移到一个新的50毫升锥形管中，用在一个1的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释:4的比例。
      注:稀释液的比例越高，可用于较高的纯度。
   3. 10毫升密度梯度介质添加到一个新的50毫升锥形管，仔细层稀释血液的密度梯度介质的顶部。离心在750 xg离心在室温（RT）下30分钟不离心制动。
   4. 小心地将血沉棕黄层转移到新的50毫升锥形管中，加入30毫升的PBS至管中，并洗涤细胞。
   5. 离心将细胞在515×g离心5分钟，在RT
   6. 丢弃PBS中重悬细胞在0.5ml血细胞介质。
   7. 计数细胞，和板，每孔1×10 ^6个细胞在24孔板的。添加PBS到周围井以防止蒸发。
   8. 转导之前，稳定5天将细胞于37℃在5％CO _2。天3-4添加而增加的0.5毫升的新鲜血液细胞培养基而不干扰细胞。

2.转导仙台病毒

1. 转导（第0天）
   1. 收集和血细胞转移到15毫升锥形管中，并使用血球计数。
   2. 准备每转3×10 ⁵细胞并离心将细胞在515×g离心在RT 5分钟。
   3. 丢弃通过抽吸上清，重悬细胞在0.5ml血细胞介质。
   4. 转移细胞到一个非涂布24孔板的孔中。
   5. 解冻仙台病毒混合物在冰中，并把它添加到苏spended细胞。仙台病毒添加到根据制造商的建议的细胞。
   6. 用密封薄膜密封板，并在30℃下在1150 xg离心离心它为30分钟。
   7. 离心后，孵育细胞在37℃下在5％CO ₂过夜（O / N）。
2. 细胞转移到饲养基质（第1天）
   1. 第二天，外套一个24孔板与玻。稀释为最终的5微克/毫升的浓度在PBS中的玻连蛋白溶液。 1毫升玻连蛋白添加至24孔平板的孔中，并在室温下孵育，然后至少1小时。使用前取下涂料解决方案。涂覆的板可以存储在室温3天。
   2. 传送含有细胞和病毒的包被的孔中的所有媒体。
   3. 收集剩余的细胞用增加的0.5毫升的新鲜血液细胞培养基，并把它添加到井的含细胞。
   4. 离心板在1150 xg离心35℃10分钟。
   5. ％之后rifugation，去除上清，加入1ml的iPSC媒体，并在5％CO ₂ O / N保持在37℃。
3. 第二小区传送（第2天）
   1. 涂层用5微克/毫升玻连新的24孔板的孔中，如在步骤2.2.1说明。使用该板的一个孔中的每个转导。
   2. 从第一板细胞悬液转移到新涂玻连板。
      注意:如果不需要，悬浮细胞可以被丢弃。在步骤2.3中提到的过程可以与悬浮细胞被重复2-3次。如果该步骤将重复，收获细胞。
   3. 同时，在5％的CO ₂ O / N在37℃下加入1 ml的iPSC介质到第一板的孔，进行维护，孵育它。
   4. 保持附着的细胞在37℃和5％的CO _2，并执行用新鲜的iPSC媒体每日更换培养基。菌落转导后14-21出现在天。
   5. CentrifugÈ含有在1150 xg离心和35℃下10分钟的悬浮细胞的新包被的平板。
   6. 离心后，孵育细胞在37℃下在5％CO ₂ O / N。
   7. 次日，去除上清，并用新鲜的iPSC媒体更换。
      注:在步骤2.3中提到的步骤可以与悬浮细胞被重复2-3次。如果该步骤将重复，收获上清液中的细胞，并重复步骤2.3。
   8. 保持附着细胞日报传媒的变化，直到达到80％汇合。

3.重编程的细胞维护

1. 24孔板培养后早期维护
   1. 转导后7-10天，一旦细胞汇合，制备玻连蛋白涂覆的60毫米培养皿中。稀释PBS玻解决方案作最后的5微克/毫升的浓度。 1毫升玻连蛋白添加到培养皿，并在室温下孵育，然后至少1小时。
   2. 洗细胞用PBS并加入1ml的PBS / 1mM EDTA中的分离的细胞。
   3. 孵育它们在37℃和5％CO ₂的2分钟。
   4. 收获细胞并在250 xg离心和RT 2分钟离心它们。去除上清，悬浮细胞在3毫升新鲜的iPSC媒体。
   5. 板上的所有悬浮细胞到新涂60毫米的菜。
   6. 在37℃下添加10毫Rho激酶抑制剂的细胞，并维持它们在5％CO _2，直到所述细胞是80％汇合。
2. 拆分菌落外观（亚克隆准备）
   1. 制备玻连蛋白包被的，100毫米的菜，如在步骤3.1.2说明。
   2. 清洗细胞，用PBS，并添加1毫升的PBS / 1mM EDTA中的分离的细胞。
   3. 孵育它们在37℃和5％CO ₂的2分钟。
   4. 收获细胞并在250 xg离心和RT 2分钟离心它们。
   5. 算使用血球细胞和每培养皿制备1×10 ^4个细胞。
   6. 离心细胞，在250 xg离心和RT 2分钟。
   7. 悬浮1×10 ^4个细胞在6ml的iPSC介质，盘它们涂布后100毫米培养皿，并添加10mM的Rho激酶抑制剂的介质。
   8. 孵育细胞在37℃，5％CO ₂的一个星期，直到大菌落出现。
      注意:保持和扩大殖民地的亚克隆。亚克隆通常是在5代做英寸
3. 殖民地采摘使用的iPSC菌落分离解决方案
   1. 菌落采摘，种子1×10 ^4个细胞在玻连蛋白包被的，100毫米的菜，如在步骤3.2.7中提到前一个星期。
   2. 加入2毫升玻连蛋白溶液，并在室温温育至少1小时制备玻璃体结合蛋白涂布的，60毫米培养皿中。
   3. 通过显微镜（40X或100X放大倍数）观察，标志用记号笔界限清楚的殖民地。从步骤3.3.2取得新盘取出玻的解决方案，并添加6毫升IPSC的介质补充有10毫Rho激酶。
   4. 从细胞中除去培养基，并用3毫升的PBS洗涤。
   5. 加入1毫升的iPSC菌落分离解决方案，并培育他们在室温为30秒。
   6. 除去从板的溶液中并在室温下孵育它为另外的30秒。
   7. 使用P200移液器，从板块吸取200微升媒体和吹打分离针对性的殖民地。转移殖民地散落到新的100毫米的菜。
   8. 孵化和在5％CO ₂维持在_37℃。
      注:获得纯的iPSC集落后，将细胞维持，直到它们到达通道10表征为至少10次传代之后进行。抗体的稀释液和引物信息示于表1和2。

结果

该协议提供了一个简单的方法来重新编程从血液中分离外周血单个核细胞。利用串行电镀和离心的组合，成功地产生的iPSC。用这种方法，可以与全血细胞的少量生成的iPSC无需分离或扩大特定的细胞类型。我们在一个小细胞培养板成功生成iPS细胞仅1×10 ^4个细胞。

重新编程之前，血细胞用密度梯度介质隔离。血细胞分离...

讨论

由于胚胎干细胞（ESCs）显示若干缺点，需要一种替代的工具的需要。因此，诱导多能干细胞由山开发（iPS细胞）在国际聚光灯下的来。它已经将近十年，因为山中发现多能性可以通过添加只有四个基因导入成年体细胞被诱导。由于iPS细胞是由成熟的体细胞"诱导"，他们可以逃避那个曾经是与胚胎干细胞的关注伦理问题。不像胚胎干细胞，可以从每个生成的iPSC。因此，它们可以在个性化医学研究和...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer