干细胞衍生的抗原特异性调节性T细胞对自身免疫的发展

摘要

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

摘要

自身免疫疾病的出现是由于免疫自身耐受丧失。调节性T细胞（Treg细胞）是免疫自身耐受的重要介质。调节性T细胞代表约5 -在小鼠和人类成熟的CD4 ⁺ T细胞亚群的10％，与约1 -这些Treg细胞在外周血中循环的2％。诱导多能干细胞（iPS细胞）可以分化成官能的Treg，其具有用于自身免疫性疾病的基于细胞的疗法的电位。这里，我们目前开发iPS细胞从抗原（银）特异性调节性T细胞（ 即 iPSC的调节性T细胞）的方法。该方法是基于结合转录因子FoxP3的和Ag特异性T细胞受体（TCR）插入的iPSC，然后分化上表达的Notch OP9基质细胞配体三角状（DL）1和DL4。 下列体外分化，所述iPSC的的Treg表达CD4，CD8，CD3，CD25，FoxP3的，和Ag-特异性TCR并能够对于Ag刺激作出响应。该方法已成功地应用于自身免疫性关节炎的基于细胞的疗法在小鼠模型。这些特定的Ag-iPSC的调节性T细胞的过继转移到银 - 诱导的关节炎（AIA）的-bearing小鼠具有降低关节发炎和肿胀，并防止骨损失的能力。

引言

Autoimmune arthritis is a systemic disease characterized by hyperplasia of synovial tissue and progressive destruction of articular cartilage, bone, and ligaments¹. The defective generation or function of Tregs in autoimmune arthritis contributes to chronic inflammation and tissue injury because Tregs play a crucial role in preventing the development of auto-reactive immune cells.

Manipulation of Tregs is an ideal strategy for the development of therapies to suppress inflammation in an Ag-dependent manner. For Treg-based immunotherapy, the specificity of the transferred Tregs is important for the treatment of ongoing autoimmunity². To exhibit the suppressive activity, Tregs need to migrate and be retained at the afflicted region, which can be directed by the specificity of the TCR for the Ag at that location³. Although polyclonal Tregs may contain a small population containing this Ag specificity from their TCRs, the numbers of these Ag-specific Tregs are usually low. Consequently, cell-based therapies using polyclonal Tregs against autoimmune disorders require adoptive transfers of a large number of Tregs^4,5. Because pluripotent stem cells (PSCs) have the ability to develop into any type of cell, Ag-specific PSC-Tregs may prove to be good candidates for Treg-based immunotherapy. Previous studies have shown the successful development of PSC-derived T cells, including Tregs^6-8.

Here, we describe a protocol to develop Ag-specific iPSC-Tregs. We further describe a cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model using such Tregs. This method is based upon genetically modifying murine iPSCs with Ag-specific TCRs and the transcriptional factor FoxP3. The engineered iPSCs then differentiate into Ag-specific Tregs on the OP9 stromal cells expressing Notch ligands DL1, DL4, and MHC-II (I-A^b) molecules in the presence of cytokines mFlt3L and mIL-7. These Ag-specific iPSC-Tregs can produce suppressive cytokines, such as TGF-β and IL-10, when stimulated with the Ag, and adoptive transfer of such Tregs has the ability to suppress AIA development in a murine model. The described protocol can be used to develop stem cell-derived Ag-specific Tregs for potential therapeutic interventions.

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研究方案

所有的动物实验是由医学动物保健委员会的宾夕法尼亚州立大学学院（IACUC协议＃45470）批准，并遵守协会的实验动物的评估和认可的准则进行。

1.干细胞培养

1. 孵育10cm皿在10阶毫升0.1N％明胶的为至少30分钟，在37℃（恒温箱）涂覆该板。
2. 从盘和板3×10 ⁶除去明胶照射SNL76 / 7细胞，并使用10％的DMEM培养基（10％FBS和1％青霉素链霉素）中于37℃（孵化）孵育一天。
3. 从板和培养解冻iPSCs的过度使用的iPSC介质SNL76 / 7细胞饲养层移除介质（含15％胎牛血清，0.1毫摩尔/升的非必需氨基酸，1毫摩尔/升L-谷氨酰胺的DMEM培养基，并0.1毫摩尔/升β巯基乙醇^）9。在小鼠iPS-MEF-NG-20D-17锂电池NE，其从通过的Oct3 / 4，Sox2的，Klf4和c-Myc的的逆转录病毒转染小鼠胚胎成纤维细胞诱导的，由山中伸弥博士（研究所再生医科学，京都大学，京都，日本）获得的。
4. 改变在第3天的介质与新鲜介质和在显微镜下观察的iPSC集落。
   注意:这些菌落小，有光泽集群或圆形细胞呈现出荧光显微镜下GFP表达一个明确的划分。

2. 在特定的Ag-iPSC的调节性T细胞的体外分化

1. 生成的构建体在逆转录病毒转导由亚克隆对OT-II T细胞受体基因和FoxP3的使用与自我裂解肽2A连结的MIDR质粒¹⁰使MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3的构建体。
2. 执行使用开发平台E细胞作为包装细胞系的iPSC的逆转录病毒转导^9。
3. 在第0天，种子OP9-DL1-DL4-IA ^B细胞通过使用含有20％FCS和为2.2g / L碳酸氢钠。板每10cm培养皿1×10 ^6个细胞的OP-9培养基（α-MEM介质10 ⁴细胞/ cm ²的た最小密度。
4. 第3天，当OP9-DL1-DL4-IA ^B细胞成为80-90％汇合，删除媒体和种子0.5 - 1×10 ⁵ iPS细胞在OP9-DL1-DL4 - IA ^B细胞OP-9介质。
   注意:此确立有关OP9-DL1-DL4-IA ^B细胞的iPSC的共培养，并被认为是分化⁹的第0天。
5. 在第5天，通过抽吸除去从10cm皿的媒体，用10ml 1×PBS中洗细胞，并吸出PBS中。添加4毫升0.25％胰蛋白酶并在37℃下孵育10分钟。在400 XG另一个8毫升的iPSC媒体的添加到细胞，重悬浮它们，离心机在室温下5分钟。
   1. 吸出上清液并重新悬浮细胞在10ml的iPSC介质。这些孵育重悬细胞上新的10 cm培养皿并返回到培养箱30分钟。
      注意:删除OP9-DL1-DL4-IA ^b饲养层细胞，并保持差异化的iPSCs漂浮在介质中。维持OP9-DL1-DL4-IA ^B细胞不断实现80 -进一步共培养90％汇合。
   2. 30分钟后，收集漂浮细胞，通过70微米的细胞滤网过滤它们，并用血细胞计数器计数细胞。
6. 种子5×10的iPSC的⁵到新鲜的80 -在OP9媒体OP9-DL1-DL4-IA ^B细胞90％汇合。补充用mFlt-3L的培养基中于5毫微克/毫升的最终浓度。
7. 在第8天，通过与来自使用10毫升吸管皿本身的媒体洗涤该板收集部分分化的iPSC。使用另一个5毫升OP-9介质的菜通过仔细的，有力的移液轻轻冲洗掉半贴壁细胞，以免在培养皿底部打破OP9单层。重复用10ml的PBS洗涤收获所有半广告赫伦特分化细胞。
   1. 在400 XG结合两种洗涤，离心，在室温下5分钟，在10含有mFlt-3L（5毫微克/毫升）和MIL-7（1纳克/毫升）OP9媒体毫升重悬浮，并通过70过滤微米的细胞过滤。
8. 转移细胞到含80 6孔培养板- 90％汇合OP9-DL1-DL4-IA ^的B细胞，如在步骤1.1。传递细胞从一个10cm平皿收获到6孔板的一个孔中。
9. 在第10天，改变半媒体从细胞到补充有mFlt-3L（5毫微克/毫升）和MIL-7（1纳克/毫升）的新鲜OP9介质。重复此步骤，每两天。
10. 每4-6天，这取决于生长，再种子微分的iPSC上板与OP9-DL1-DL4-IA ^的B细胞的新鲜层，如在步骤1.1中描述。

3. 在体外 Treg细胞的分化和成熟的评价

1. iPS细胞分化的形态变化。
   1. 莫nitor与OP9-DL1-DL4-IA ^B细胞的iPSC的共培养每天通过常规亮场显微镜（20X）下观察活细胞。第5天，观察与中胚层样的特点，如扁平细胞集落。到第8天，观察细胞的小而圆簇，它代表分化细胞。
   2. 使用台盼蓝排除法计数细胞来检测活细胞的数量和百分比。计算细胞存活率作为活细胞的血细胞计数器的四个网格内的细胞的总数除以数。如果电池占用台盼蓝，认为他们死的或不能存活的。记录从培养收获的活细胞的数量。
2. 流式细胞仪iPS细胞分化的分析。
   1. 天5，7，11，15，19，21，和共培养28除去用0.25％胰蛋白酶的细胞如在步骤25。
   2. 之前用不同的荧光标记的抗体的表面染色，incubatë1×10 ^6个细胞用100μl，在4℃，20分钟，在PBS中（最终浓度为10μg/ ml）稀释的Fc阻断2.4G2的，以防止抗体的结合在细胞表面上的Fc受体。
   3. 天5，7，11，15，19，21，和28，流式细胞仪使用1×10 ^6个细胞用于流具有不同荧光标记的抗体来检测细胞表面标记物，包括CD3，TCRβ，CD4，CD8，CD25，和CTLA4。
   4. 以下的Fc块，洗涤细胞用10ml的PBS和染色用不同荧光染料标记的抗体进行20分钟，在4℃，然后执行与15色流式细胞分析流式细胞仪。使用抗体的0.200微克每于100μlPBS中稀释10 ^6个细胞。
   5. 在第28天，分析细胞通过流式细胞仪¹¹和栅极上用CD4和CD8荧光标记染色^的 CD4 ⁺ CD8 ⁺细胞;分析TCRVα2，TCRVβ5，CD25，CTLA表达-4，和FoxP3的（ 图1）。对于FoxP3的染色，修复细胞，它们permealize，然后进行抗体染色^11。
3. iPS细胞在体外抗原刺激。
   1. 上共培养，收获iPSC的调节性T细胞从通过收集漂浮细胞培养第28天。 Trypsinize用0.25％胰蛋白酶的细胞的其余部分（如在步骤2.5）和重新悬浮的细胞在8ml的iPSC介质。离心机在室温下以400 xg离心5分钟，吸出介质，并再次重新悬浮细胞在10ml的介质。
      1. 孵育在一个新的10cm平皿重悬浮的细胞在37℃下30分钟，收集漂浮细胞。清洗细胞用冷PBS。
   2. 在4℃小鼠在200μl的媒体为5μM卵清蛋白肽（OVA _{323-339），}用于在一个96孔板¹¹ 30分钟- / -从C57BL / 6 RAG1脾脏孵育3×10 ^6个脾细胞。
   3. 混合调节性T细胞与OVA _323-339 -pulsed 在1脾:4的比例（0.75用×10 ⁶的Tregs）。在CO ₂培养箱中进行40小时在37℃。在过去的4小时，加入4微升稀释布雷菲德菌素A的到培养基（实际浓度1000倍，在1×培养基稀释）。
   4. 收获的细胞用0.25％胰蛋白酶（如在步骤2.5），洗净，用10％NaN ₃的和0.5M EDTA溶液（FACS缓冲液），块用100μl稀释（终浓度为10μg/ ml）的Fc阻断2.4G2，和染色对下述表面标志物，CD4，CD8，TCRVα2和TCRVβ5如步骤3.2.3-3.2.4。
   5. 固定在PBS中的4％低聚甲醛溶液中的细胞，并用100μl1×透化缓冲液的细胞表面染色后通透。 注意！多聚甲醛是过敏，致癌和有毒的。
   6. 染色用荧光标记的TGF-β和在黑暗中20分钟的IL-10的细胞。使用0.200微克抗体/ 10 ^6个细胞dilutED 100微升的PBS。检测胞内产生的TGF-β和IL-10与15色流式细胞仪（ 图2）。
   7. 清洗细胞三次前的流式细胞仪分析¹¹冷FACS缓冲液。
4. 在抗原特异性iPSC的调节性T细胞的体内持久性。
   1. 后共同培养的上^{OP9-DL1-DL4-IAβ}细胞8天，转移源自iPSC的预调节性T细胞（Thy1.2），为在经由步骤3.3.1进入祢1.1同类系小鼠（4-6周龄）尾静脉注射无需麻醉。之前执行所述尾静脉注射，扩张尾静脉用红外线灯进行5分钟。尾静脉扩张后，放置在一个限制器鼠标和继转移3×10 ^6个细胞重悬浮于200μl的PBS通过尾静脉注射。
   2. 在调节性T细胞转移后六个星期，通过安乐死_的 CO ₂窒息的小鼠颈椎脱位。确保英里CE都没有了呼吸。通过切割使用剪刀和镊子腹膜的外皮，并轻轻拉回来，以暴露内壳衬里腹膜腔打开腹腔。隔离脾注入你的1.1同类小鼠的外周淋巴结。
   3. 收集来自使用机械破碎，得到单细胞悬浮液的脾和淋巴结细胞。孵育细胞用5ml ACK裂解缓冲液中5分钟，在RT以裂解红血细胞。收集和洗涤剩余的脾细胞或淋巴细胞用10毫升冷流式细胞仪缓冲的。
   4. 继洗涤，治疗与在4℃下与Fc受体阻滞剂2.4G2 20分钟的细胞如步骤3.2.2和染色用100μl稀释荧光标记的抗Thy 1.2抗体的产生。
   5. 洗涤细胞，用10ml FACS缓冲液，并进行流式细胞仪分析^11。

4. 在体内成熟和抑制自身免疫性关节炎

1. 生成的构建体如在步骤2.1。
2. 执行逆转录病毒转导⁹如在步骤2.2。
3. 在体内分化和关节炎诱导小鼠。
   1. 区分的OT-II T细胞受体/ FoxP3的转导的iPSC（OT-II的FoxP3 / iPSCs的），对细胞因子mFlt-3L的存在下OP9-DL1-DL4-IA ^b基质细胞的FoxP3转导的iPSC和DsRed的转导的iPSC和2.6 - 白细胞介-7 8天的步骤2.1节所述。
   2. Trypisinize所有三种细胞从10cm平板，并重新暂停从每个10cm平板的细胞在10ml新鲜的培养基。细胞添加到新鲜的10cm平板，并返回到培养箱30分钟。 30分钟后，收集漂浮的细胞。
   3. 通过细胞通过70微米的细胞滤网以除去细胞团并使用血细胞计数器计数。调节细胞在冷PBS中的1.5×10 ^7个细胞/ ml的浓度，并根据需要再进行过滤。保持细胞在冰上，直到过继细胞转移到小鼠体内。
   4. 注入200微升细胞悬浮液（3×10 ^6个细胞）至4的三个不同的组- 6周龄的雌性C57BL / 6小鼠通过尾静脉如3.4.1中所述
   5. 在细胞转移后第10天，注入100 MBSA微克在弗氏完全佐剂在尾的基部通过用1ml注射器乳化的小鼠。
   6. 第17天，麻醉用异氟烷蒸发器（根据IACUC准则）小鼠。利用4 - 诱导5％异氟醚和1 - 维护2％。在右膝关节诱导了20微克MBSA的关节内注射关节炎于10μlPBS中的左膝关节和20微克MBSA和100​​μg整体OVA于10μlPBS中。食品和GELPACK可放置在被褥地板关节炎已开发之后。将小鼠安乐死:2/5或垂死的，严重的恶病质和/或持续斜卧（24小时周期）体况评分（BCS）和严重度评分4.在比分4，红斑和肿胀严重涵盖踝，足和数字，或肢体的ankyloses。
4. 对OT-II TCR / FoxP3的转导的iPS细胞的表征。
   1. 使用荧光显微镜（20X）来可视化未定影活DsRed的⁺ GFP ⁺细胞。
   2. 检查由双方印迹基因整合和表达和流式细胞仪^11。
5. 调节性T细胞的发育和成熟。
   1. 在周2，4和6中的细胞转移后，安乐死的小鼠。在第一阶段2升_的 CO ₂ -对于安乐死，每个笼子使用1。一旦动物已失去知觉，增加_的 CO ₂的流率，以4 - 5升/分钟。安乐死的CO ₂吸入老鼠。隔离脾和通过切割用剪刀和镊子腹膜的外皮，并轻轻拉回来，以暴露内壳衬里腹膜腔排出淋巴结。
   2. 收集单细胞悬液˚FROM用细胞过滤网，并在1％的iPSC媒体1ml注射器由机械故障的脾脏和淋巴结。离心含有在400克介质5分钟的锥形管中。重悬在5ml ACK裂解缓冲液中的细胞沉淀以裂解红血细胞。重新离心机以1,000rpm 5分钟。重悬细胞沉淀，并用冷FACS缓冲液洗涤剩余的脾细胞或淋巴细胞。按照步骤3.4.4 - 3.4.5，并进行流式细胞仪分析。
6. 细胞内染色。
   1. 关于天50攻击后，分离脾，并用CO安乐死后沥干小鼠的淋巴结（如在步骤_4.5.1）2吸入颈椎脱位。
   2. 收集来自用细胞过滤网和1ml注射器，机械故障的脾和淋巴结的单细胞悬浮液。在室温下孵育的脾细胞5分钟5毫升的ACK裂解缓冲液以裂解红血细胞。收集和洗涤剩余的小号plenocytes或淋巴细胞用冷FACS缓冲。按照步骤3.2.3 - 3.2.4，但与污渍表面标志CD4，CD8，CD25和TCRVβ5。
   3. 继续如3.3.5所述修复细胞内染色- 3.3.7和分析活CD4 ⁺ CD25 ⁺细胞中胞内细胞因子产生（TGF-β和IL-10）的源自iPSC的调节性T细胞的和栅极。
7. 在膝盖抗原特异性调节性T细胞的浸润和关节炎的抑制。
   1. 天7 -下面的步骤（4.3.6 4.3） - 14关节炎诱导后（按照IACUC准则）用CO安乐死的小鼠₂吸入颈椎脱位。从膝盖用电动剪清除头发和手术切除膝盖。
   2. 通过使在与钝端剪刀后腿的切口移除腿部皮肤和抄近路穿过大腿和向下到脚踝的皮肤。轻轻剥离在腿部和脚部，以暴露肌肉皮肤。去掉从腿部肌肉小心不损坏膝关节。
      1. 切开后腿只是骨盆/髋关节上方用锋利的解剖剪刀剪胫骨。
   3. 修正了4％福尔马林膝盖48小时。脱钙使用2.5M的甲酸膝盖;三次漂洗在二甲苯为3分钟，在100％乙醇漂洗两次，在95％的乙醇冲洗两次，在去离子水中漂洗两次2分钟，并在1毫摩尔EDTA脱钙。治疗在20分钟的子沸点温度（90℃）。
   4. 冷却该固定组织30分钟。用1X PBS冲洗4分钟，并嵌入在石蜡。通过一系列乙醇浴脱水组织以置换水，然后用蜡渗透它们。然后嵌入渗透到组织蜡块。执行对染色纵向和横向切片。准备4微米的部分采用了侧滑切片机。
   5. 在deparaffi的标准程序后各部分进行免疫荧光染色nization及补液使用二甲苯和乙醇^12。
   6. 通过浸渍在3％的过氧化氢溶液的足够量的滑动为银检索之后3分钟阻断内源性过氧化物酶的活性。块幻灯片中的非特异性的3％BSA在PBS中在室温下在潮湿的腔室60分钟的结合。
   7. 染色切片用200μl荧光标记TCRVβ5抗体的稀释1:在封闭溶液100。孵育在75室温2小时 - 100％湿润的腔室，并在1×PBS洗涤5次，每次5分钟。
   8. 染剂用于核染色的幻灯片含DAPI的抗淬灭剂。加约300微升稀释DAPI染色溶液（300nM的在1×PBS中）的盖玻片，使得确定整个盖玻片覆盖。在4℃下储存在黑暗中滑动，直到用荧光显微镜（ 图3）下分析。
8. 关节炎抑制试验
   1. 通过使用拨号规卡尺，以建立基线测量关节炎诱导前小鼠的两个膝盖的肿胀。
   2. 按照步骤（4.3 - 4.3.6）关节炎的诱导和Treg转移。测量膝盖鼠标使用拨号规卡尺后Treg细胞转移。
   3. 计算膝盖直径增加的百分比:百分比增加=（膝盖直径第1天 - 第0天膝关节直径）/第0天膝关节直径。
9. 通过组织学在膝盖关节破坏和炎症细胞浸润的测量（ 图4）。
   1. 后第7天，关节炎诱导，安乐死如前所述小鼠和由外科手术切除的膝盖。请参阅步骤4.7.1 - 4.7.2。
   2. 修复膝盖在4％福尔马林，在EDTA脱钙，并在石蜡嵌入。请参阅步骤4.7.3
   3. 卸下两个膝盖，固定在10％福尔马林，并在Formical-4钙化。嵌入石蜡，部分组织在4微米，并与hematoxyl染色在和伊红（H＆E）或番红O染色（如步骤4.7.7），并观察显微镜下。
   4. 使用H＆E染色半定量计分系统来评价骨侵蚀（0:无糜烂; 4:扩大糜烂和骨质破坏）。使用番红O染色来评价蛋白多糖的损失，并用半定量计分系统评分（0:无蛋白多糖损失; 3:蛋白聚糖染色完全丧失）。
      1. 使用半定量评分系统的得分上H＆E染色的载玻片的炎性细胞浸润（0:无细胞浸润; 4:盛产细胞浸润）。通过采用盲法研究双膝评价分数。

5.在与高分辨率微型计算机断层扫描（微CT）系统的膝盖骨损失的测量

1. 第10天的后关节炎诱导麻醉，用2％异氟醚的小鼠和用于成像做准备。
2. 麦克风的位置e为在腔室朝上的膝盖。
3. 使用高分辨率微型CT系统在周围的小鼠的膝盖骨结构的体内成像来获取。
4. 执行微CT扫描了2.2毫米的长度，包括鼠标膝关节使用以下参数:10.5微米体素尺寸在55千伏，145微安200毫秒的积分时间，211的图像。
5. 进口显微CT图像和捕获额面图像进一步图像处理（体积渲染和转换）（ 图5）之后。

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结果

如这里所示，在第28天，抗原 - 特异性的Treg基本上表达CD3和抗原特异性T细胞受体，两个T细胞标记。该CD3 ^+TCRVβ5+人口表示CD4。大多数CD3 ^+TCRVβ5+ CD4 ⁺细胞也表达CD25，CD127，和CTLA-4，这是在天然存在的Ť _暂存器 （nTregs）和在表达FoxP3的异位性T细胞在升高的水平一般表示的。在源自iPSC的细胞中的FoxP3表达与所述Notch配体

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讨论

在这个协议中，一个关键的步骤是TCR / FoxP3基因转导的iPSC的体外分化。 在体外 Notch信号传导诱导发展朝向T细胞谱系。分化的iPSC成CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ Treg细胞，我们使用了OP9-DL1 / DL4 / IA ^的B细胞，其中高表达MHC II类分子^（ⅠAB）的分子。大部分的iPSC的分化成CD4 ⁺细胞。然而，表面TCR表达后，许多分化的前T细胞失去分化并最终死亡的能力。其结果是，在?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6j mice	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Anti-CD3 (2C11) antibody	BD Pharmingen	553058
Anti-CD28 (37.51) antibody	BD Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5) antibody	Biolegend	100417
Anti-CD8 (53–6.7) antibody	Biolegend	100714
Anti-CD25 (3C7) antibody	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) antibody	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Integrated science	204130
ACK Lysis buffer	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
Gelatin	Sigma	G9391
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Permeabilization buffer	Biolegend	421002
mBSA	Sigma	A7906
Ova albumin	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Tailveiner restrainer	Braintree scientific	RTV 150-STD