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摘要

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

摘要

寨卡病毒（ZIKV）是链接到胎儿发育异常，如小头畸形，眼缺陷，和受损生长一个新兴的病原体。 ZIKV是黄病毒科的RNA病毒。 ZIKV主要是由蚊子传播的，但也可以通过母体传播给胎儿的垂直传播和性接触。迄今为止，有可用的，以保护那些被病毒感染没有可靠的治疗或疫苗的选项。可重复的，有效的兹卡病毒感染的细胞培养系统的发展是研究ZIKV复制以及药物和疫苗发展的分子机制的关键。在这方面，描述的哺乳动物细胞为基础的体外寨卡病毒培养病毒的生产和生长分析系统的协议在这里报道。对一个细胞单层和斑块比色法检测病毒滴度形成斑块由寨卡病毒的详细介绍。病毒基因组复制动力学和双链RNA基因组replicatory中间体被确定。此培养平台利用屏幕对一小部分产生的干扰素α（IFN-α）的鉴定细胞因子的文库，IFN-β和IFN-γ作为寨卡病毒生长的有效抑制剂。总之， 在体外感染寨卡病毒培养体系和各种病毒学测定法证明了在本研究中，这也在研究界中进一步阐明病毒致病机制和病毒毒力的演变极大地受益的可能性。抗病毒的IFN-α还可以作为预防，暴露后预防性，和治疗的高危人群寨卡病毒感染，包括病毒感染的孕妇选项进行评估。

引言

兹卡病毒（ZIKV）是小头畸形及妊娠结局不佳有关1,4重要的人类病原体。 ZIKV属于集合医学相关的黄病毒可导致神经缺陷，如登革热，西尼罗河，和圣路易脑炎病毒。病毒传播的主要方式是通过蚊子载体埃及伊蚊 ，并且，此外，性传播也有报道5,6。 ZIKV已经成为一个主要的全球性健康问题，由于蚊子的地域扩张分布及其与出生缺陷密切相关。 ZIKV最早是在1947年从兹卡森林定点恒河猴隔离，乌干达和第一个人类病例报告，1952年7,8。个人认为感染了ZIKV存在轻度症状，如发热，皮疹，头痛，结膜炎和肌肉/关节疼痛。受感染的孕妇可以传输ZIKV发育中的胎儿1。 žIKV感染也被链接到吉兰巴雷综合征，外周神经自体免疫脱髓鞘病症9。

的寨卡病毒基因组由一个正感，单链RNA分子，其长度为约10.8千碱基的。基因组的结构被组织成5'NCR-C-的prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR，与非编码区域（NCR）侧翼的蛋白质编码区6。一个单一的多聚（3419 AA）被翻译的是合作和翻译后切割成10小肽。无论是5'NCR和3'NCR RNA茎环结构在病毒基因组翻译和复制生效的重要组成部分。基因组的结构部件是由衣壳，膜和包膜蛋白。非结构蛋白是基因组复制的关键。

目前，寨卡病毒株被分成三个主要的基因型:西非，东非和亚洲6,10-13。有人提出，蔓延到西非和亚洲，后来进一步发展12东非血统。亚洲基因型负责在美洲当前疫情。寨卡病毒可以是在这两个蚊子和哺乳动物细胞中培养。初级真皮成纤维细胞，未成熟树突状细胞，皮层神经祖细胞，Vero细胞易受寨卡病毒感染10,14,15。 I型和II型干扰素已显示限制在皮肤成纤维细胞15 ZIKV增长。这项研究的目的是提供用于生产和亚洲基因型ZIKA病毒株PRVABC59的化验在哺乳动物细胞培养系统的逐步，详细的协议，并证明这种传染病文化体系作为药物开发平台的效用。此资源具有对兹卡病毒和神经学研究界进一步阐明我受益非浅的潜力病毒发病机理和病毒的毒性进化TS机制。

研究方案

注:工作流程的示意图外形如图1所示。

1.细胞

  1. 使用Vero细胞为寨卡病毒生产和病毒复制周期的分析。
  2. 制备含有10％牛胎儿血清（FBS），2mM的L-谷氨酰胺，青霉素（100单位/ ml），链霉素完全生长培养基（100单位/ ml），和10mM HEPES。
  3. 培养Vero细胞在37℃，5％CO 2的指定的完全生长培养基。

2.兹卡病毒生产

  1. 在收获80％的细胞密度用0.25％的胰蛋白酶在T-75烧瓶中Vero细胞和细胞计数。
    1. 吸从T-75培养烧瓶中的介质并用2ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）漂洗细胞。
    2. 加2ml的0.25％胰蛋白酶的孵育在37℃的烧瓶5分钟。
    3. 加入8毫升血清的含有生长培养基以灭活胰蛋白酶。吸取上下SUS挂起细胞和细胞转移到15毫升管。
    4. 取出10微升细胞与等量0.4％台盼蓝混合。加载准备组合，以细胞计数室幻灯片，并获得活细胞使用自动细胞计数器计数。
  2. 种子共有7百万个细胞在30ml的量成T-160瓶。
  3. 第二天，在每烧瓶10ml的无血清培养基制备感染的寨卡病毒接种物的适当复数（0.01到0.1的MOI）。
  4. 从T-160烧瓶中取出用过的培养基，然后添加新鲜制备的病毒接种物（10毫升）中。
  5. 用5％的CO 2孵育接种的烧瓶在37℃4-6小时。轻轻地在每一个小时横盘倾斜瓶传播接种。
  6. 在温育完成后，取代对每个烧瓶暖血清补充的生长培养基（30毫升）的接种物。然后继续为下96小时的病毒培养。
  7. 验证的进展通过使用相差显微镜，并采取必要的40X和200X放大倍率的图像（ 图2）观察对细胞单层的病毒斑的出现染。

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图2:不同放大倍率的由寨卡病毒在Vero细胞上的单层形成斑块明场图像显示在48 HPI寨卡病毒噬斑。注意圆形细胞灶上单层的存在。 （比例尺= 50微米）， 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在96小时的时间点和离心上清在300×g离心10分钟，在4℃下收获细胞培养物上清液以除去细胞碎片。
  2. 小心取出上清液，而不干扰沉淀杂物和转让ŤO 15毫升管。可以进行超速离心24,000 XG集中的病毒颗粒（可选）。
  3. 在-80℃保存在多个等份病毒培养上清液。

斑块检测3.测量兹卡病毒滴度

  1. 种子幼稚Vero细胞以每孔1×10 5个细胞于2ml体积使用12孔板中。
  2. 次日，制备10倍使用无血清培养基的T-160烧瓶中收集病毒培养上清的系列稀释液。从各取出废传播媒介，一式三份添加400微升准备接种到Vero细胞上。
  3. 孵育37接种的烧瓶 °下用5％CO 2的4-6小时。轻轻在每1小时侧身倾斜板蔓延的接种。
  4. 在孵育结束时，替换与血清补充培养基的接种物（2毫升，每孔）。
  5. 在48小时后接种，使用相对照计数病毒灶AST显微镜。计算病毒滴度为每毫升空斑形成单位（PFU）。 见图3斑块检测。
  6. 固定和染色在20％乙醇中制备用于噬斑清晰的​​可视化在4％甲醛将细胞与0.1％的结晶紫溶液。

4.兹卡病毒基因组复制测定

  1. 种子幼稚Vero细胞以每孔1×10 5个细胞于2ml体积使用12孔板中。一式三份使用无血清培养基低和高滴度;第二天，制备病毒接种物（400微升/孔的0.01和0.1的MOI）。对于模拟感染，只使用无血清培养基（400微升/孔）。
  2. 重复步骤3.2至3.4。
  3. 在48和96小时的时间点，收集RNA和免疫细胞化学（ICC）的样品。
    1. 收获的RNA的样品，取出介质，然后添加400微升裂解液直接向每个孔和收集裂解物。
    2. 对于ICC，删除媒体和T母鸡加入1毫升甲醇到每个孔中固定细胞，并在4℃下孵育该板30分钟。
    3. 从细胞裂解物中，分离使用根据制造商的指令的RNA分离试剂盒提取总RNA。量化使用分光光度计的RNA。
  4. 执行两步逆转录定量PCR（RT-qPCR的），以确定从收获的RNA中ZIKV基因组的内容。
    1. 为了扭转转录RNA，首先建立在0.2毫升管组成的分离RNA的5微克，1微升的dNTP（10毫米），1微升随机六聚体（250毫微克）13微升反应混合物。孵育管中，在65℃进行5分钟，然后将其放置在冰上一分钟。接着，加入1微升反转录酶，4μl的5×链合成缓冲液，1微升的0.1M二硫苏糖醇，和1微升RNA酶抑制剂的反应混合物。孵育在25℃的管进行额外的5分钟，随后60分钟在50℃和inactiv吃加热15分钟，反应至70℃。
    2. 使用qPCR 1微升产生的cDNA的12.5微升2个绿色染料混合超级含有DNA聚合酶和1微升10毫具体为兹卡病毒[寨卡病毒泛基因引物（对于单个引物进行:5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3' ;启:5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3'），寨卡病毒亚基因型PRVABC59菌株的引物（5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3';启:5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3'）]，或丙型肝炎病毒（JFH RTQ F:5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R:5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'），或细胞持家基因GAPDH（有关:5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3';启:5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3'）在25微升反应体积。
    3. 使用运行条件95℃15秒和60℃下，在一个实时PCR系统30秒（40个循环）进行PCR。
    4. 使用GAPDH表达水平的基础上周期阈值（Ct）正常化在ZIKA病毒基因组的测量。计算相比，GAPDH的基因组兹卡的三角洲的Ct（ΔCT）值并获得2ΔCT值。然后，通过利用被感染的和未感染的细胞之间规格化孜卡基因组含量比在指定的时间点计算倍数变化。参见图4 ZIKV基因组复制的结果。
  5. 使用甲醇固定的细胞进行ICC。
    1. 洗固定的细胞三次用1×PBS和与ICC封闭缓冲液阻断（3％山羊血清，3％的BSA，0.1％的Triton-X的PBS中100）。
    2. 以1:1的稀释度使用小鼠单克隆抗dsRNA的抗体J2（1微克/毫升）:100在封闭缓冲液并在4℃下孵育过夜。
    3. 洗用1×PBS的细胞中并在一个1添加二级抗体的山羊抗小鼠IgG-594（1微克/毫升）:1000稀释在封闭缓冲液孵育在室温下1小时。
    4. 洗用1×PBS和染色细胞用Hoechst的染料细胞核和观察使用放大100倍的荧光显微镜（ 图4）的细胞。

5.细胞因子筛选对图书馆兹卡病毒感染

  1. 种子幼稚Vero细胞以1×10 5细胞每孔用12孔板中。一旦细胞附着（6小时后播种），在生物重复所示浓度（2毫升体积/孔）添加每种细胞因子。包括车辆（PBS）单独控制。
  2. 在12小时的后处理，执行寨卡病毒感染（每孔0.1于400μl的MOI）。包括阴性对照孔，无感染（模拟）。
  3. 在4小时后感染，替换细胞因子处理的介质（2ml）中的病毒接种物。孵育细胞在37℃下额外44小时。
  4. 在48小时后感染，计数用相差显微镜病毒噬斑和在40X放大倍率（ 图5）获得感染的细胞的代表性图像。

结果

一个兹卡病毒株;亚洲基因型（PRVABC59 GenBank登录号KU501215）得到使用，这项研究12。被用于研究从头寨卡病毒感染的Vero细胞在80％汇合。对于病毒生产和随后的病毒学特征，早期通道（P3）兹卡病毒使用。上观察到感染的第二天病毒斑块。孜卡从最初感染的细胞释放的病毒后代可以扩散到相邻细胞，这导致在单层培养物（ 图2）可见斑块的形成。?...

讨论

这里， 在体外培养寨卡病毒精简协议被提出。关键步骤包括，确定最佳的终点扩大病毒培养，测量滴度，并量化基因组复制被提供。寨卡病毒是一种人类病原体，因此，在处理感染性物质，生物安全程序必须严格遵守。阿猴肾细胞系，Vero细胞，用于展示各种病毒学检测。寨卡病毒复制动力学可以在各种组织和物种的细胞不同。可以如前面15所描述的使用的其他细胞系。寨卡病毒已?...

披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red  Corning25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%Life TechnologiesT10282
Countess – Automated Cell CounterThermoFisher ScientificC10227
Countess-cell counting  chamber slidesThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 English & Scientific Consulting Kft.10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR SystemThermo Fischer4471088
RNase-Free DNasePromegaM6101
Vero Cell Line ATCCCCL-81
Zika viral strain PRVABC59Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6Peprotech200-06             
IL-1 alpha       Peprotech200-01A          
TNF-alphaPeprotech300-01A          
Interferon alpha A  R & D Systems11100-1
Interferon betaPeprotech300-02BC
Interferon gammaPeprotech300-02
Centrifuge 5415REppendorf5415R
Centrifuge 5810REppendorf5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFINikonVisit Nikon for Request

参考文献

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