对细胞的超快磁化阳离子化Magnetoferritin的合成

摘要

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

摘要

许多重要的生物医学应用，如细胞成像和远程操作，可以通过用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）标记的细胞来实现。实现SPIONs的足够细胞摄取是历来满足通过使细胞暴露于升高的浓度SPIONs的或通过延长曝光时间（最多72小时）是一个挑战。然而，这些策略可能介导的毒性。在这里，我们提出了基于蛋白质的SPION magnetoferritin的合成以及一个浅显的表面功能化协议，使细胞快速磁化使用低接触浓度。 magnetoferritin的SPION核心由掺钴 - 铁氧化物与马脾脱辅基铁蛋白的腔内部8.2纳米矿化的平均颗粒直径。 magnetoferritin的化学阳离子产生使用温育时间作为一种新型的，高的膜 - 活性SPION该磁化人类间质干细胞（hMSCs）短短一分钟的铁浓度低点0.2毫米。

引言

表面结合或超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）的内部，使多种类型的细胞的磁化的应用，如成像和远程操作。 ¹然而，实现充分的蜂窝磁化可能是一个挑战，尤其是当SPION和细胞表面之间的相互作用弱。 ²在过去，长时间暴露或高SPION浓度已用作策略来克服这一挑战。 ^3,4-然而，这些策略是有问题的，因为它们增加毒性^5,6-并在细胞类型具有低的内化速率，如淋巴细胞非常有限的成功。 ⁷为了提高SPIONs的细胞摄取，几个表面官能化的方法已被探讨。例如，抗体已经被用于促进受体介导的内吞作用^，8而能使用的转染一个来实现非特异性摄取绅士^9,10或细胞穿透物种，例如HIV TAT肽。 ^11,12然而，抗体和肽官能的方法是通过昂贵的试剂和复杂的合成制备的限制，而转染试剂可诱导的纳米颗粒的沉淀和细胞功能产生不利影响。 ^13,14

我们最近报道化学阳离子magnetoferritin的合成中，使用的孵育时间短至一分钟新颖SPION这是在磁化的人类间充质干细胞中高度有效（hMSC）的培养。 ¹⁵ Magnetoferritin被重构的储铁蛋白铁蛋白的去离子腔内SPION合成。 ¹⁶该蛋白质基SPION结合了许多特性使其非常适合用于细胞磁化，如在由蛋白质外壳赋予的磁芯^，17-19和生物相容性和水溶性的磁特性的控制。进一步以上，表面官能化是容易由于寻址氨基酸可以是化学^20-22或遗传修饰实现的。 ^23-25我们已经表明，该蛋白质壳的酸性氨基酸残基的化学阳离子产生容易与细胞表面导致快速和持续的细胞的磁化上的阴离子域相互作用稳定纳米颗粒。这个过程消除了费力的官能化和冗长孵育协议的需要，并且由于非特异性标记机制此快速磁化战略应找到在其他细胞类型广泛的应用。在这里，我们提出了超快速的细胞标记方法的深度报告，包括阳离子magnetoferritin的合成，提纯和表面功能的详细协议。

研究方案

人类骨髓间充质干细胞（hMSC）作为从接受全髋关节置换手术，完全按照布里斯托尔Southmead旅馆医院研究伦理委员会的指导方针（参考＃078/01），得到病人的同意后，骨关节炎患者股骨近端骨髓收获。

1. Magnetoferritin合成和纯化

1. 总论
   1. 在65℃氮气氛下在一个密封的，双夹套反应容器中执行magnetoferritin合成以限制金属前体的氧化。通过接入端口在盖成使用注射泵将反应容器注入金属盐溶液和过氧化氢。
   2. magnetoferritin合成后，通过净化阴离子交换色谱蛋白质（参见1.4节）删除没有用蛋白质纳米腔，其次是尺寸排阻色谱法（见1.5）分离蛋白单体。德使用Bradford测定termine蛋白浓度（参见1.6节）。
2. 准备工作之前，合成
   1. 通过将连接到在水中氮气气缸的管，密封与保鲜膜容器，并通过氮气进行大约60分钟鼓泡脱氧500毫升去离子水。
   2. 热连接到双夹套反应容器到65℃的水浴中。加75毫升50毫4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（pH 8.6）到反应容器中，通过经由缓冲溶液约20分钟，使氮气鼓泡密封容器中，和去氧。在同一时间，搅拌使用磁力搅拌器的缓冲溶液。
   3. 脱氧的HEPES缓冲溶液后，取出管从缓冲器供给氮气，并保持它悬浮在保持氮气气氛的容器中。添加脱辅基铁蛋白来实现的3毫克/米的最终浓度湖继续磁力搅拌，但如果发生发泡降低搅拌速度。
   4. 通过在50毫升脱氧去离子水0.19克溶解制备硫酸钴七水合物的25mM储液。
   5. 通过在100毫升脱氧去离子水0.98克溶解制备的铁硫酸铵六水合溶液的25mM溶液。
   6. 中除去2.5毫升铁硫酸铵六水合溶液和2.5毫升硫酸钴七水合物的替换。
   7. 通过首先将965微升过氧化氢溶液（30％W / W）到9毫升脱氧去离子水，然后加入1ml这个分库存来99毫升制备的脱氧去离子水中的过氧化氢的8.33毫溶液脱氧去离子水。
3. Magnetoferritin合成
   1. 注入10.1毫升两个铁 - 钴前体与过氧化氢的同时进入脱辅基铁蛋白溶液（磁小号tirred）在以0.15毫升使用两个注射泵/分钟的流速（总体积注射20.2毫升）中。
   2. 在注射期间，脱氧另外500毫升去离子水。
      注意:反应容器的内容物逐渐采用暗褐色随着反应的进行。
   3. 不久第一次注射完成之前，准备另一个百毫升铁 - 钴前体，并使用新鲜的脱氧去离子水的过氧化氢溶液。
   4. 重复使用铁 - 钴和过氧化氢的新制备的溶液在1.3.1中描述的注射步骤。
   5. 在注射期间，脱氧另外500毫升去离子水，并在1.3.3和1.3.4所述进行操作。
   6. 在第三次注射后，离开溶液成熟搅拌下15分钟。
   7. 加为1.5ml的1M柠檬酸钠溶液到反应容器中以螯合游离在溶液中的金属离子。
   8. 除去从反应后的溶液容器到50ml离心管，离心在4,350 xg离心30分钟，并通过0.22μm注射过滤器传递上清液。在这一阶段，经过滤的上清液可以储存于4℃直至纯化。
4. 离子交换色谱法
   1. 加载样品在含有用蠕动泵以10毫升/分钟的流速的阳离子基质的柱（直径为2.5厘米，长20厘米）。
   2. 与有约100ml用梯度泵以10毫升/分钟的流速运行缓冲液（50mM三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）缓冲液，pH 8.0）洗涤柱。
   3. 为了洗脱蛋白质，以10ml /分钟洗涤柱子用氯化钠（NaCl）的Tris缓冲液浓度的增加:150，500和1000毫最终NaCl浓度，加入150ml各浓度。
   4. 作为蛋白质洗脱在500毫的NaCl浓度，使用自动级分收集器收集它在50毫升馏分。
      注:对于离子交换层析的详细的协议协商先前公布的协议。 ²⁶
5. 尺寸排阻色谱法
   1. 浓缩150毫升magnetoferritin来的使用一个15毫升的离心过滤器单元随后4ml的体积单元约2毫升体积。参考离心过滤单元的制造商的说明（参见材料清单）此过程的详细协议。
   2. 加载浓缩样品到使用注射循环凝胶过滤柱。
   3. 用运行缓冲液（50mM Tris缓冲液，pH值8.0，含有150mM NaCl）中以1.3毫升/分钟的流速洗柱。
   4. 收集用自动级分集流管6毫升级分。蛋白质单体洗脱过去的。在这一点上，纯化magnetoferritin可以储存在4℃直至阳离子。
      注:对于使用凝胶过滤柱的尺寸排阻色谱法的详细协议协商previously出版协议。 ²⁷
6. 确定蛋白浓度
   1. 制备使用市售马脾铁蛋白的0.06，0.125，0.25,0.5和1mg / ml，在50mM Tris缓冲液铁蛋白的标准。
      注:可商购的铁蛋白的蛋白质浓度在瓶子中指出。如果没有，与供应商联系以获得该信息。
   2. 稀释未知浓度的magnetoferritin样品在50mM Tris缓冲，直到溶液的颜色为0.5mg / ml标准的颜色大致相匹配。记下稀释倍数。
   3. 添加10微升一式三份每个标准和magnetoferritin试样到96孔平板的孔中。
   4. 加入200μl现成Bradford试剂以每个孔（参考材料清单用于Bradford测定试剂详细信息）。
   5. 在室温下孵育8分钟。
   6. 使用测量在λ= 595nm处的吸光度酶标仪。
   7. 积的铁蛋白的标准平均吸光度作为蛋白质浓度的函数，并使用线性拟合的斜率和截距来计算magnetoferritin样品的浓度。
      注意:考虑到这是用来调整magnetoferritin样品，通过标准曲线稀释因子。

2. Magnetoferritin阳离子化

1. 总论
   注:对于magnetoferritin阳离子，N，N-二甲基-1,3-丙二胺（DMPA）偶联到使用N-对MF表面上天冬氨酸和谷氨酸残基- （3-二甲氨基丙基） - N'-ethylcarbodiimide盐酸盐（EDC）。
   1. 进行在室温下在搅拌下进行反应。下面给出的协议为10毫克magnetoferritin的在5毫升 （蛋白质浓度2毫克/毫升） 的总体积的阳离子化。然而，放大或缩小通过保持蛋白质:DMPA:EDC比率相一致，以及缓冲和magnetoferritin溶液的体积。
   2. 之前的阳离子化反应中，透析的magnetoferritin样品到含有50mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液（pH 7）。这是很重要的，除去的Tris洗脱缓冲液，避免的Tris胺和EDC·活化的羧酸残基之间的不希望的反应。确定蛋白质浓度透析后，把它调整到阳离子/ ml的前4毫克。
2. 阳离子协议
   1. 称出374毫克的DMPA和2.5毫升的200mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液溶解。
   2. 调整用浓（6M）盐酸（HCl）溶液的pH值至约7。
      注意:执行在通风橱中此步骤中，作为添加酸的DMPA释放有毒气体！
   3. 添加2.5的magnetoferritin溶液混合物在4毫克/毫升（最终concenMES的tration为100mM，magnetoferritin的最终浓度为2毫克/毫升，蛋白质的总量为10毫克）。
   4. 加磁力搅拌器和搅拌2小时达到平衡。
   5. 仔细调整使用1M的HCl溶液至pH 5.0。
   6. 141毫克EDC粉添加到DMPA / magnetoferritin解决方案。
   7. 继续搅拌3.5小时。
   8. 过滤通过0.22微米的注射器过滤溶液以除去任何沉淀物。
   9. 添加该溶液至透析管与12-14 kDa的分子量截止和透析针对4升含有50mM NaCl的2天，4℃50mM磷酸盐缓冲液（pH 7），取代的透析缓冲液的至少三个在此期间倍。
      注意:在这一点上，阳离子magnetoferritin可以储存在4℃直至进一步使用。

3.人力间充质干细胞标记与阳离子化Magnetoferritin

1. 总论
   1. 在37℃和5％二氧化碳的气氛下进行使用II类层流柜和加湿培养箱所有细胞培养物。
   2. 培养细胞作为使用单层175厘米²烧瓶和20毫升培养基，将其每3补充的- 4天。培养基由Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），含有1000毫克/升葡萄糖，10％（体积/体积）胎牛血清，1％（体积/体积）青霉素/链霉素溶液，1％（V / V）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液和5纳克/毫升新鲜补充人类成纤维细胞生长因子。
2. 的hMSC磁标记与阳离子化magnetoferritin
   1. 种子150000的hMSCs成为25cm ²烧瓶中并离开粘附过夜，在37℃。
   2. 过滤通过0.22微米的注射器过滤器消毒的阳离子化magnetoferritin并确定蛋白质浓度。
   3. 保持无菌的条件下，准备阳离子化magnetoferri的0.5微米的解决方案在磷酸锡缓冲盐水（PBS）。保持封在无菌培养罩直到使用。
   4. 洗铺板的细胞用2ml室温PBS中。
   5. 1毫升灭菌阳离子magnetoferritin溶液添加到接种的细胞孵育所需的时间段（1分钟至1小时）。
   6. 通过加入0.5ml的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），并在37℃孵育5分钟，用PBS洗细胞，然后收获细胞。
   7. 加入1ml培养基的灭活胰蛋白酶/ EDTA，在524×g下将溶液转移至15毫升离心管中并离心5分钟。
   8. 弃去上清液并重新悬浮于0.5ml的细胞沉淀磁选缓冲液，由0.5％（重量/体积）胎牛血清和2mM EDTA的PBS中。
3. 磁性细胞分离
   1. 磁体连接到所述多台，和一个磁选列添加到磁体。放在日的预剥离过滤器Ë列。
   2. 放置0.5毫升磁选缓冲液中预分离滤波器，让它通过滤波器和清洗和湿它们列都运行。
   3. 放置一个15毫升的离心管列之下。
   4. 加入0.5毫升细胞悬浮液中的磁性分离柱的过滤器储存器。
   5. 当水库是空的，将0.5ml磁分离缓冲。
   6. 当水库是空的，进一步增加0.5毫升磁选缓冲。
   7. 重复一次（用于洗涤应1.5毫升磁选缓冲器的总体积）。此洗涤步骤洗脱所有非磁化细胞从塔（未磁化细胞级分）。
   8. 从磁体取出柱，并将其放置在一个新的15ml离心管中。从塔储除去的过滤器。
   9. 1毫升磁选缓冲器添加到储存器和通过该柱使用由制造所提供的柱塞立即推河此洗脱从柱到离心管（磁化细胞级分）的磁化的细胞。
   10. 离心两管在524×g下5分钟。
   11. 弃去上清液并重新悬浮在0.3ml毫升的PBS细胞沉淀。
   12. 计数细胞数在每个级分使用血球数。
   13. 确定磁化细胞级分中，M（％），使用以下等式:
       
       其中，n（M）是细胞中的磁化馏分和n的数量（M + NM）是细胞中的磁化和未磁化的级分的数目的总和。
4. 制备使用电感耦合等离子体发射光谱标记为铁量化阳离子化magnetoferritin的hMSCs（ICP-OES）
   注:该协议可能需要适于其他ICP-OES仪器。这是明智的重新咨询sponsible技术员。
   1. 离心的已知数量的细胞在524×g下5分钟。
   2. 除去PBS上清，加入为0.25毫升50％（体积/体积）硝酸。
   3. 涡混合酸化细胞悬液。
   4. 在室温下孵育过夜。
   5. 加4.75毫升蒸馏水向每个样品并涡旋混合。
   6. 用ICP-OES分析。 ²⁸
   7. 归一化测定铁含量对细胞的数目，以确定蜂窝铁含量的值。

结果

TEM被用来确认脱铁铁蛋白腔内纳米颗粒矿化和确定平均芯尺寸（ 图1A和1B）。未染色magnetoferritin样品的图像分析，得到的8.2±0.7纳米的平均芯径，和金硫葡萄糖染色证实纳米颗粒的蛋白质笼子内的存在。注意，图像显示用磁选分离均一纳米粒子核被进一步纯化magnetoferritin样品。没有磁净化的Magnetoferritin样品具有稍宽核心尺寸分布。采用选区电子衍射的magnetoferritin芯的结构²⁹分析表明基于磁铁矿的反尖晶石结构的_铁 （Fe ₃ O _4）和/可能存在或磁赤铁矿（γ- _的 Fe ₂ O _3），以及尖晶石结构由于共₃ O _4。此外，拉曼光谱揭示归因于_四氧化_三铁，少量的γ- _的 Fe ₂ O ₃的，和钴铁氧体（ 图1 C）的峰。 magnetoferritin的ICP-OES分析表明，铁的102微克和0.9微克每magnetoferritin毫克钴的平均值。

示意图包括，示出了随后的阳离子化步骤（ 图2的A）。 magnetoferritin和阳离子magnetoferritin的流体动力学直径分别为11.8±1.1纳米和12.5±1.4纳米，如通过动态光散射来确定。共价DMPA耦合的阳离子化效率magnetoferritin使用ζ电电位和基质辅助激光解吸电离时间飞行（MALDI-TOF）质谱法进行评估。 Zeta电位从-10.5 mV的改变MF到+ 8.3毫伏阳离子化magnetoferritin，确认一在从负的表面电势改变为阳性（ 表1）。质谱实验中发现20.1 kDa的亚基分子量为本地APO-铁蛋白和21.1 kDa的对阳离子APO-铁蛋白（ 图2 B）。该质量增加对应于每蛋白质亚基大约12耦合DMPA分子和288残基上的整个24亚基蛋白的阳离子化。

磁饱和度和磁化率是用SQUID磁力测定，并且使用磁共振成像测定的横向和纵向弛豫。磁特性分别为magnetoferritin和阳离子magnetoferritin相似，这表明阳离子对封闭SPION（ 表1）的磁特性的影响可以忽略。此外，这些性能类似于其他氧化铁基纳米颗粒^，19,30证明，认为阳离子马格纳toferritin将如适合作为增强成像对比常规的基于SPION-MRI造影剂。

30分钟的曝光后，细胞表面密布着阳离子magnetoferritin（ 图3 A）。然而，在一周后，没有纳米颗粒在细胞表面（ 图3B）上找到。阳离子magnetoferritin是在磁标记的hMSCs非常有效。值得注意的是，将细胞暴露于阳离子magnetoferritin一分钟导致的细胞群体的92％的磁化强度和3.6皮克每细胞的铁的递送。增加孵育时间来导致整个细胞群体（ 图3 C）的磁化15分钟。

图1:magnetof 表征 erritin芯掺杂有5％的钴。与金硫葡萄糖（A）和未染色（B）染色magnetoferritin的TEM照片。插图显示了磁铁矿指数对应的电子衍射。比例尺:20纳米。 （C）为拉曼光谱magnetoferritin。箭头指示钴铁氧体（T _2G），磁铁矿和赤铁矿（既是_1G）的主要拉曼振动模式。 ^31,32所使用的激光波长为532纳米。 （图片改编自Okuda等^18）。请注意，此magnetoferritin样品已经使用磁分离，其分离均匀加载magnetoferritin颗粒被进一步纯化。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2:magnetoferritin 的阳离子。 A）的溶剂可及表面积的表示示出酸性（红色的蛋白质表面上的分布）和基本的（黄色）的氨基酸残基。 Magnetoferritin（1）通过对蛋白质表面（3）上的酸性氨基酸残基的DMPA碳二亚胺介导的交联修饰以阳离子magnetoferritin（2）。 B）的脱辅基铁蛋白和阳离子脱辅基铁蛋白亚基的质谱分析。通过MALDI-TOF产生质量 - 电荷（M / Z）脱铁铁蛋白的谱（APOF）和阳离子脱铁铁蛋白（猫APOF）。从20.1 kDa的的质量增加21.1 kDa的是阳离子后观察。 （图片改编自科雷亚的Carreira 等 ^15） 点击此处查看该图的放大版本。

图3: 磁性标签和阳离子化magnetoferritin培养的hMSCs细胞分离。 A）与阳离子magnetoferritin 30分钟孵育后的hMSCs的TEM图像。箭头指示密密麻麻在细胞表面上magnetoferritin芯的存在。比例尺:200纳米。标记后的hMSC一周B）的 TEM图像。细胞表面是明确的阳离子magnetoferritin的。 C）的调查磁性标记的快速性:细胞群体的92％是一分钟的曝光与阳离子magnetoferritin 0.5微米后磁化，并且整个细胞群体的15分钟内被磁化。每个细胞的铁含量使用ICP-OES确定的。从三个生物学重复平均值和标准偏差被示出。 （图片改编自科雷亚的Carreira 等人¹5） 点击此处查看该图的放大版本。

	MF	CAT-MF
流体动力学直径[nm]的	11.8±1.1	12.5±1.4
Zeta电位[MV]	（ - ）10.4±0.2	8.3±0.7
磁饱和磁矩[AM2 公斤 -1]	54.9±1.6	55.3±1.4
质量磁化率[×10 4 m 3的kg的-1]	1.75±0.08	1.75±0.07
纵向弛豫[MM -1秒-1]	2.6±0.1	2.3±0.1
横向弛豫[MM -1秒-1]	44.6±1.0	52.8±0.8

表1:magnetoferritin 的物化表征（MF）和阳离子magnetoferritin（CAT-MF）。 （改编自科雷亚的Carreira 等表^15）

讨论

与金硫葡萄糖染色magnetoferritin样品的TEM揭示了蛋白质内笼的纳米粒子成功矿化。电子衍射和纳米颗粒核的拉曼分析表明钴铁氧体的情况下，指示与钴的纳米颗粒核的成功掺杂。这表明混合氧化物纳米颗粒能成功是APO-铁腔内矿化。此外，我们已经表明先前钴掺杂可以通过改变加入到反应混合物中，使磁特性的调谐的钴前体的量而变化。 ¹⁸

Magnetoferritin合成可在各种容器，只要它们是紧密地密封，并具有通过它可以引入的反应物（ 例如 ，一个三颈圆底烧瓶中）接入端口来执行。反应温度应在65℃下或者通过放置在容器中保持水/油浴中或使用双夹套容器中。这里，我们使用的双夹套电化学电池设置以执行合成。为了保证成功地合成，保持正确的pH值，并避免水溶液的氧污染是至关重要的。金属盐溶液应随时准备使用，而不是提前新鲜之前。此外，商业脱铁铁蛋白溶液可以在质量发生变化，影响合成的结果（ 例如 ，纳米颗粒核矿化的大小）。它可以帮助在脱铁铁蛋白溶液透析到合成之前的50mM HEPES缓冲液（pH 8.6），以除去由生产商所用的任何残留的还原剂。它是使一便条用于合成的脱辅基铁蛋白溶液的批号是有用的，因此它可以从制造商应该附加材料必须被购买具体要求。此外，市售的脱辅基铁蛋白的蛋白质浓度应在瓶子中说明，它可以用于计算所需的合成脱辅基铁蛋白溶液的体积。如果不是这种情况，与供应商联系以获得该信息。

如在这里和在先前的报告中提出- -逐渐加入金属盐和过氧化氢的优点是，纳米颗粒核的矿化可以被控制，使得不同的负载系数（ 即，纳米颗粒大小）就可以实现。 ³³此外，有可能以纯化magnetoferritin进一步使用磁性分离柱， 例如，填充有电磁铁内固定不锈钢粉末的柱。 ³⁴因此，高度的单分散纳米粒子核可以被从散装magnetoferritin样品中分离。然而，对于磁性细胞标记如这里提出这不是必需的。 magnetoferritin合成的限制是10％左右的相对低的合成产率，以及商业脱辅基铁的成本相对较高的rritin解决方案。然而，脱辅基铁蛋白也可从由以下建立脱矿化协议铁蛋白便宜地提供马脾制备。 ¹⁶

magnetoferritin的阳离子通过加入DMPA 250分子和每个负电荷的残基的EDC 50分子的摩尔比来实现（计算基于马脾铁蛋白的氨基酸序列）。这样，多余的试剂在蛋白质导致了高效率的阳离子化，也可比以往报告的铁蛋白的阳离子化结果。 ³⁵对于MALDI-TOF分析，脱铁铁蛋白和脱铁铁蛋白的阳离子化进行，因为magnetoferritin芯的过度分子量的使用。为了产生高效率的阳离子化，最适pH也是至关重要的。 EDC介导的交联是温和的酸性条件下最有效，而我们发现，pH为5，得到为magnetoferritin最佳阳离子化的结果。然而，对于其他蛋白质cationization pH值可能需要进行优化。阳离子化在或接近蛋白质的等电点应该避免，因为这可能会导致严重的沉淀。

与阳离子化magnetoferritin干细胞磁化是高效，并可能使用的温育时间远远低于30分钟达到。甚至一分钟孵育导致3.6皮克，这是影响用于MRI T2和T2 *对比所需的报告的范围内的蜂窝铁含量。 ^36,37这也是显着的，这有效的标记与外低铁浓度达到。例如，使用阴离子纳米粒子以往的研究报告有30分钟的潜伏期为5毫米的铁后，每单元10微克的铁含量。 ³⁸相比较而言，孵育用含有0.5μM的蛋白质的阳离子magnetoferritin溶液对应于孵育约0.2mM的铁和也产生约10皮克每CEL铁升在30分钟后。我们无法清楚地确定用TEM的内吞囊泡。然而，使用阳离子化铁以往的研究发现，前十分钟的暴露内发生内化。 ^39,40阳离子化铁蛋白能够在小泡，网格蛋白说明或小窝依赖的内吞进行本地化。同一研究还报告说，孵育30分钟后，阳离子铁蛋白仍然存在于细胞表面上，以及在多泡体，类似溶酶体。

进一步的应用可包括装载有其他纳米颗粒和/或功能分子，如抗癌药物⁴¹或量子点⁴²脱辅基铁蛋白笼的阳离子。这些铁蛋白结构的阳离子，可能会导致他们的货物细胞的更快，更高效地交付。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	BPE310-1	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen	Sigma Aldrich	A3641	we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	C6768	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate	Sigma Aldrich	F1543	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%)	Sigma Aldrich	216763	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate	Sigma Aldrich	S1804	powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron	Merck Millipore	SLGP033RS	syringe filter
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434	poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units	Merck Millipore	4310	Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis	Merck Millipore	UFC801024	Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml
ANX Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare	17-1287-04	we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17-1196-01	this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system	GE Healthcare	28406264
sample pump P-960	GE Healthcare	18-6727-00	load sample at a flow rate of 10 ml/min
automated fraction collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00
Bradford assay reagent	Sigma Aldrich	B6916	solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen	Sigma Aldrich	F4503	prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA)	Sigma Aldrich	308110	CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma Aldrich	E6383	keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	AppliChem	A0689,0500	powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane	Sigma Aldrich	D9652	soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose	Sigma Aldrich	D5546	warm in 37 °C water bath before use
fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F7524	add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution	Sigma Aldrich	P0781	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
glutamax solution	Gibco	35050-087	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor	PeproTech	100-18B	add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml
phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	D8537	sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution	Sigma Aldrich	E5134	keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134	powder; make a 2 mM solution in PBS
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7030	add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for attachment of MACS magnet
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet	Miltenyi Biotec	130-042-102	can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407	30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66%	Sigma Aldrich	7006
Titrando 907, syringe pump	Metrohm	2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5	Molecular Devices		Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX	JEOL		Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer	Renishaw		Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser	Laser Quantum		Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme	Applied Biosystems		Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS	Malvern Instruments		Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System	Quantum Design		Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra	Siemens		Used to determine longitudinal and transverse relaxivity
Tecnai 12 BioTwin Spirit	FEI		Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES	Agilent		Used to determine iron content in cells