心脏重构通过大鼠腹主动脉缩窄的模型

摘要

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

摘要

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

引言

心脏衰竭是一种复杂的临床综合征，其中包括疲劳，呼吸困难症状，运动耐受力，和体液潴留在外围组织。它是死亡的发达国家¹的首要原因。除了引起的肌节蛋白质或离子通道²突变遗传性心肌病，心肌功能障碍可以通过各种医学病症，包括高血压，心脏瓣膜疾病，肥胖和糖尿病³引起的。在心肌结构，电传导，和能量代谢导致心脏泵送能力不足的变化，以满足循环的要求，最终导致心脏衰竭^3,4。调查心脏衰竭背后的机制，因此，是在心血管领域的研究非常重要。识别导致心脏衰竭恶化的分子机制，最终可以帮助在新的治疗目标的或有用的生物标记物的发现 1。因此，开发出与人类⁵心脏衰竭共享关键临床特征心脏衰竭的动物模型非常重要的。

心脏肥大和重塑起着心脏衰竭的发展中起关键作用。高血压心脏疾病是心肌肥厚和人类患者¹所示的适应不良重塑的关键因素。模仿这些人类的条件下，动物模型通常通过外科手术成立。特别是，在横向或腹主动脉可以收缩，以增加对左心室，这最终导致在心脏的压力超负荷的阻力。这种现象通常导致心脏肥大，心肌细胞的一生理补偿，以满足对心血管系统的功能需求。然而，功能需求覆盖了正常的生理代偿机制，导致心肌纤维化和承包商瓷砖损害。横向主动脉缩窄（TAC）手术往往涉及复杂的程序，包括开胸，机械通气和胸腺分离和脂肪组织从主动脉弓。相比之下，腹主动脉缩窄，需要简单的实验技术^6-8。腹主动脉，在左右肾动脉之间，是在手术过程中收缩。心肌肥厚和重塑可在腹主动脉缩窄手术后^6-8可以观察到几个星期;它们产生类似于由横向主动脉缩窄术^9,10-生成健壮高血压心脏疾病。在这里，我们描述了一种协议使用高效的，高度可再现的，和微创方法大鼠进行腹主动脉缩窄。邻近肾动脉腹主动脉通过由4-0丝线形成的0.72毫米环收缩。手术，心脏肥大和remodelin十周后g的被观察到。腹主动脉缩窄致心肌肥大的大鼠模型为研究疾病机理与病理生理学，以及潜在疗法的发展平台。

研究方案

所有的动物实验均按照指南实验动物的护理和使用，卫生的美国国立卫生研究院公布（NIH公开号85-23，1996年修订）进行。该协议被批准，并按照规定设置的机构动物护理和使用委员会台大的准则。

1.动物手术

1. 通过钝的针尖上的珩磨石制备22克的注射器针头。使用钳子，折扇针直角。
2. 手术前，准备所需的手术器械和材料，以及作为恢复笼。使用前高压灭菌所有仪器和手术用品。
3. 维持约200克老鼠，并让他们在12小时亮/暗周期在控制温度（21±2℃），免费获得食物和水。包括至少6只大鼠各组中使用。麻醉戊巴比妥大鼠（75毫克/公斤0.5毫升，IP）或另一种适当的麻醉剂。通过测试尾反射确认麻醉深度。
   注意:没有尾反射的是充足的麻醉的一个指标。
4. 将在仰卧位老鼠在手术平台，加热垫，以保持体温。剃鼠的腹部区域与动物毛发推剪和毛发去除洗剂，以避免手术污染。擦洗优碘或手术之前，另一个清洁剂的干净剃光腹部。
   注:保持整个过程中的无菌场是很重要的。
5. 使沿着用手术刀腹部中线2厘米的切口。在手术过程中使用生理盐水，保持腹腔脏器湿润。仔细置换消化器官用棉球，以暴露下腔静脉即位于后腹膜区域的一侧。识别腹主动脉，其位于并列并通常在离开下腔静脉。
   注:腹主动脉是在时间上与心脏速率脉动容器中。
6. 刺破腹膜一双镊子到下面揭露的船只。轻轻隔离邻近肾动脉的腹部大动脉，并传递一个8厘米长的4-0丝线缝合右侧的起源和左肾动脉之间的腹主动脉下方。
7. 请用缝线一个松散的双结;留3毫米直径的环形，并放置迟钝和弯曲22克针在循环内。拧紧围绕主动脉和针的结，然后立刻取出针达到0.7毫米直径的收缩。
8. 用6-0可吸收缝合线材料关闭腹腔。缝合肌肉或皮肤切口，用简单的间断缝合。为了防止感染，擦洗手术部位用碘酒。
9. 仔细观察动物，直到它重新获得足够的意识，通过自由移动指示和食物摄取。无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。以防止手术后的疼痛，治疗与对乙酰氨基酚（于0.5ml 300毫克/千克，IP）的大鼠。
   注:用户应给予止痛药批准的体制政策。

2.组织和血液样品采集

1. 10周手术后，称重大鼠并（0.5毫升，IP 75毫克/千克）用戊巴比妥麻醉它。手术前，通过测试其尾部反射确认麻醉深度。放置鼠上的金属托盘。
2. 使沿使用手术刀颈部的中线2厘米的切口。仔细取代肌肉用钳子暴露气管。仔细观察，以确定在颈动脉，其中平行于气管和在时间上与心脏速率脉动。
3. 收集从颈动脉血液进入涂有EDTA的血液收集管。立时离心机血在2000 XG 15分钟，收集血浆。直到需要在-80存储血浆℃。
4. 使5厘米的切口在胸部区域，围绕xyphoid过程的中线。皮尔斯锋利的钳隔膜。使用剪刀，切割和去除肋骨沿两侧中期锁骨线暴露心脏。仔细切除的心脏沿心脏和血管的边界。不抓组织轻轻取出心脏。
5. 通过捆绑主动脉树干灌注针安装在修改后的Langendorff灌流心脏。灌注用Krebs缓冲液的心脏（含有110 mM氯化钠，2.6毫摩尔的KCl，1.2毫摩尔KH ₂ PO _4，1.2毫_硫酸镁 ，25mM的_碳酸氢钠 ，和11毫米的葡萄糖[pH为7.4]）洗出血液。权衡的心脏，并计算心脏重量到身体重量比。修正了冰4％多聚甲醛的心脏。记得要戴口罩，因为水蒸气多聚甲醛是TOX我知道了。

3.组织纤维化定量

1. 将组织切片设备上的多聚甲醛固定的心脏组织，切2mm厚的部分。放置的组织切片中的包埋盒。通过一系列梯度乙醇浴（50％，75％，95％，并且对于每个1小时100％）的脱水的组织。
2. 渗透用二甲苯组织1小时，最后在蜡1小时。放置渗透组织成一个包埋盒和石蜡嵌入。储存在室温下石蜡块的包埋组织直到显微切片。
3. 切片包埋组织成4微米厚的切片。放置在部分45ºC水浴。以一个角度浸载玻片放入水浴中，并逐渐接近石蜡切片边缘，以允许部分附着到滑动。
4. 移动滑动进出浴下的组织切片去除潜在的气穴，并促进更好附件。干ŧ他滑动在37ºC1小时，并将其在室温下储存用于组织学染色。
5. 把滑入的槽。 Deparaffinize用二甲苯滑动30分钟，并在顺序地稀释酒精再水合它（95％，75％和50％对每个3分钟）和最后在蒸馏水中。使用足够天狼猩红溶液完全覆盖组织切片1小时。冲洗在0.5％的乙酸溶液的幻灯片两个变化，然后在无水乙醇执行两个漂洗。
6. 风干载玻片和盖玻片安装在合成树脂的幻灯片。照片在可见光领域的幻灯片。
   注:红色区域中的照片显示了在200倍显微镜下天狼猩红正面区域。计算天狼猩红正面区域超过总面积，这表明纤维化¹¹的程度的百分比。

4.血肌钙蛋白定量

1. 量化血浆肌钙蛋白水平使用酶联免疫吸附测定（ELISA）。测定一式两份每个样品。负载血浆的50微升和50微升的抗体鸡尾酒到适当孔中。密封该板，并在400rpm在室温下孵育1小时在板振荡器上。
   注:在血浆中心脏肌钙蛋白是心肌损伤的标记物。
2. 吸出液体，并用250微升洗涤缓冲液三次洗每个孔中。最后一次洗涤后，翻转板吸干对清洁纸巾除去多余的液体。
3. 加入100μl四甲基联苯胺底物至每孔，并孵育在黑暗中10分钟上以400rpm板振荡器。加入100微升终止液到每个孔中。摇板振荡器上在板1分钟以混合。记录450nm处的光密度（OD）。
   注:肌钙蛋白浓度是成比例的OD值。

结果

腹主动脉缩窄手术10周后，将得到的心肌病理分析。心脏组织学是通过计算心脏重量的体重的比率，并通过在心脏检测胶原蛋白的量来测量。心脏损伤，通过测定血浆心肌肌钙蛋白浓度证实。

如在图1A中所示，心脏大小腹主动脉缩窄手术后放大，由更高心脏重量到体重比（ 图1B），心脏肥大的指标作为...

讨论

Hypertensive heart disease, a major health problem that contributes greatly to morbidity and mortality, can lead to cardiac hypertrophy and heart failure⁵. The pathogenesis and progression of hypertensive heart disease in humans is complex, so an appropriate animal model is critical to investigate the underlying mechanisms and to test novel therapeutics that aim to improve cardiac structure and function⁵. The abdominal aortic constriction model, which simulates chronic heart disease, is an effective...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G syringe needle	BD Biosciences	309572
EDTA Blood Collection Tubes	BD Biosciences	REF365974
4-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	441244
Acetaminophen	Sigma Aldrich	A7085
Picrosirius red solution	Abcam	ab150681
Cardiac troponin kit	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular Dynamics
Langendorff	ADInstruments	ML870B2