一种利用共振能量转移（FRET）的生物传感器-force议定书衡量所有核LINC复杂的机械力

摘要

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

摘要

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

引言

力敏感，遗传编码的FRET传感器最近出现的用于在活细胞中测量基于拉伸力，提供深入了解的机械力跨蛋白^{1，2，3，4}施加的重要工具。有了这些工具，研究人员能够以非侵入性图像内的力量在使用传统的荧光显微镜的活细胞。这些传感器由通过弹性肽³分离的FRET对（供体和受体荧光蛋白，最频繁蓝色供体和黄色受体）的。在对比C-或N-末端标记，该传感器被插入到测量跨蛋白质传递的机械力的蛋白质的内部位点，表现为一个分子应变计。增加跨越传感器的结果的机械张力在FRET-P之间的距离增加空气，导致降低FRET ^3。其结果是，该FRET是负相关的拉伸力。

这些基于荧光的传感器已被用于粘着斑蛋白（纽蛋白³和踝蛋白^4），细胞骨架蛋白（α辅肌动蛋白^5），和细胞-细胞连接蛋白显影（E-钙粘蛋白^6，7，VE-钙粘蛋白^8，和PECAM ^8）。在这些生物传感器中最常用的和充分表征的弹性连接体被称为TSmod和由40个氨基酸_{，（GPGGA）8，}其从所述蜘蛛丝蛋白衍生鞭的重复序列组成。 TSmod已经显示出表现为线性弹性纳米弹簧，与FRET响应要求1至拉伸力³ 5对-N。鞭状的不同长度可以被用于改变所述动态řTSmod FRET力灵敏度⁹的安格。除了鞭状，血影蛋白重复⁵和绒毛头戴受话器肽（称为^HP35）4已被用作在类似力的生物传感器⁴ FRET对之间的弹性的肽。最后，最近的一份报告显示，TSmod也可用于检测压缩力^10。

我们最近开发了用于细胞核-细胞骨架（LINC）复合蛋白Nesprin2G的接头的力传感器，通过使用TSmod插入称为迷你Nesprin2G（ 图2C），其行为类似于内源性一个先前开发的截短的蛋白Nesprin2G Nesprin-2G ^11。在LINC复杂包含了从外面导致细胞核内，连接细胞质细胞骨架的核纤层的多种蛋白质。 Nesprin-2G是结构蛋白结合到两个肌动蛋白骨架在细胞质和核周空间SUN蛋白质。使用我们的生物传感器，我们能够证明Nesprin-2G是受制于NIH3T3成纤维细胞肌动球蛋白²依赖紧张。这是第一次力在核LINC复杂的跨蛋白直接测量，它很可能成为了解力在力学生物学的核心作用的重要工具。

下面的协议提供的如何使用Nesprin-2G力传感器，包括在哺乳动物细胞中Nesprin张力传感器（Nesprin-TS）的表达Nesprin-细胞的FRET图像的表达，以及采集和分析了详细的方法TS。使用配备有光谱检测器的倒共焦显微镜，如何测量敏化发射的描述使用FRET光谱分离，并设置比例FRET成像。输出比率的图像可以被用来制造相对QUAntitative力比较。虽然该协议的重点是Nesprin-TS的成纤维细胞中的表达，这是很容易适应其它哺乳动物细胞，包括细胞系和原代细胞。此外，该协议，因为它涉及到图像采集和分析FRET可以容易地适用于已经被用于其它蛋白开发了其他基于FRET的力生物传感器。

研究方案

1.获取Nesprin-2G传感器DNA和其它质粒DNA

1. 从商业来源获得Nesprin-2G TS（张力传感器），Nesprin-2G HL（无头）控制，mTFP1，金星和TSmod。传播的所有DNA的质粒，并使用标准的大肠杆菌菌株，如DH5-α，净化他们如先前^12,13说明。

2.转染细胞与Nesprin-2G和其它质粒DNA

1. 生长NIH 3T3成纤维细胞的细胞至70-90％铺满在6孔细胞培养皿中在标准的细胞培养培养箱中温（37℃）和CO _2（5％）调节。对于细胞生长培养基，用Dulbecco氏补充有10％胎牛血清的改良的Eagle培养基（DMEM）。
2. 在细胞培养罩，除去培养基并用约1mL降低血清细胞培养基冲洗每一个孔。添加降低血清细胞培养基中的800μL到每个孔并放置在培养箱中在6孔腔。
3. 吸移管700降低血清细胞培养基到1.5mL管中的脂质载体溶液35μL的μL以形成"lipomix"。通过移液混合。标记管具有"L"。
4. 收集6个的1.5mL管中并标记它们1到6吸取100μL的降低血清细胞培养基到每个管中。
   1. 从步骤1中，移液管2 Nesprin 2G-TS的微克使用质粒DNA的浓度成管1和2。移液器2 Nesprin-HL的微克到管中3和4移取1 MTFP的微克到管5移液器1微克mVenus的入管6吹打不同类型的DNA时，不要再使用移液管尖端。
5. 移液管将100μL从"L"管到每个标记的管（1-6）的lipomix的，并通过反复吹打混匀。使用干净的吸管每个管。孵育10-20分钟。
6. 从每个标记的管加入200微升到井在6孔室具有70-90％汇合的细胞。标签的每个井的顶部与相应的DNA溶液。放置6孔室在4-6 h的培养箱中。
7. 吸出介质，并添加减少的血清细胞培养基中的1-2毫升冲洗。吸出降低血清细胞培养基，加入胰蛋白酶的2 mL至每个孔中，并将其放置在6孔培养皿在培养箱（5-15分钟）。
8. 虽然细胞在培养箱中分离，涂层6玻璃底在溶解于磷酸盐缓冲盐水（PBS）20微克/毫升的浓度与纤连蛋白的一个层观看菜肴。允许的菜涂覆在细胞培养罩（约20分钟）的表面上。
9. 加入2毫升的DMEM一旦细胞被分离中和胰蛋白酶。
10. 传送每个孔中的物质与标记的15-mL离心管中，并在摇摆转子离心机降速在90×g离心5分钟。吸出上清液并重新悬浮用移液管混合在DMEM 1000微升的各细胞沉淀。
11. 抽吸从纤连蛋白混合物玻璃菜肴和吸管每个细胞悬浮液的1000μL到玻璃培养皿。
12. 后的细胞沉淀到的玻璃盘的底部（〜15分钟），在细胞培养箱中添加另外1毫升的DMEM + 10％FBS + 1％青霉素 - 链霉素向每个孔和地点。允许细胞附着并表达传感器，用于至少18-24小时。
    注:电池使用商用阳离子脂质转染试剂（见材料的表 ）转。可替代地，稳定的细胞系可以通过使用质粒与基因赋予对毒素进行选择（所述的pcDNA质粒为Nesprin-TS和-HL上可用的DNA库网站（参见材料的表 ）提供表达遗传霉素抗性细胞）。此外，病毒感染的方法（慢病毒，逆转录病毒，或腺病毒）可用于表达在，是很难转染细胞的传感器。
13. 除了Nesprin-TS，转染的细胞附加与Nesprin HL零为CE控制，如在以下步骤中描述2.1-2.12; TSmod也可以用作零力控制并且应当表现出相似的FRET到Nesprin-HL。
14. 转染细胞用mTFP1和金星，以产生频谱指纹（参见步骤4）。
    注:mTFP1和金星通常表达水平高于Nesprin-TS，并且同样地，低量的DNA可能需要被转染的，以实现相似的表达水平。

3.确认转染效率

1. 大致完成转染后18-24小时，使用倒置荧光显微镜通过荧光细胞的数目相比较，以在视图细胞（通常为5-30％）的总数来检查转染的效率。
   1. 使用配备有接近462纳米（mTFP1）或525纳米（金星）和近492纳米（mTFP1）或525纳米（金星）为中心的发射滤波器的激励频率的荧光显微镜。
      注:另外，GFP过滤器组将捕获mTFP1的组合，并且已经NUS排放和允许的转染效率的确认。
2. 转染后48个小时内的图像的活细胞。
   1. 可替代地，在固定的4％多聚甲醛（与钙和镁的PBS中）5分钟，储存于PBS中，视图细胞48小时后^8。
      注意:超过48小时，信号质量和强度衰减。固定细胞保持它们的状态，其中包括FRET中表达^8;然而，细胞只应在PBS成像，如固定介质可能影响FRET ^14。固定的细胞仅可相对于其他固定的细胞，因为有可能在表达的变化。
      注意:多聚甲醛是有毒的。穿戴合适的个人防护装备（PPE）。

mTFP1和金星荧光基团的4捕捉光谱指纹光谱分离

1. 在细胞培养罩，更换成像mediu细胞培养基米（HEPES缓冲的），补充有10％胎牛血清。
2. 放置观看碗碟的温度受控（37℃）共聚焦显微镜阶段。
3. 将带有mTFP1转染的细胞在油物镜的玻璃的观看菜在60X放大倍数为1.4的数值孔径。
   注:此油经激光扫描显微镜中使用的60X物镜到接近于玻璃基板的折射率。油放置在物镜的顶部并且与玻璃盖玻片直接接触。
4. 定位mTFP1表达细胞与458 nm激发源，并在500纳米为中心的发射带通滤波器。
5. 随着视场荧光细胞，选择（在这里所使用的软件"LAMBDA模式"）的光谱检测模式和捕获分光图像（ 图3-1）;包括除了使用10度纳米的增量（ 图3-3）458nm处的所有频率。选择明亮fluoresc在电池（20像素的半径）ENT区域（ROI）。
   注意:mTFP1表达ROI的频谱形状应保持在单元相对恒定。如果该形状变化很大，重新调整激光和增益的设置，以改善信噪比。
6. 通过单击添加荧光ROI的意思是，归一化强度的光谱数据库"光谱保存到数据库中。"
7. 优化激光功率和增益，使得良好的信噪比得以实现。设定适用于不同的设备而有所不同。使用非荧光，未转染细胞作为背景参考，提高增益和功率，直到所述细胞是明亮的，但不超过检测器（饱和点）的动态范围。背景细胞不应该在平均后检测的荧光。
8. 重复此过程，金星转染的细胞，但下列情况除外:
   1. 确保激励频率是在515纳米和该带通滤波器是CE定位金星表达细胞时接近530纳米ntered。
   2. 在"光谱模式"，使用的515nm的，而不是458纳米的激发频率。

5.捕获未混合的图像

1. 切换拍摄模式为"光谱分离。"
2. 添加金星和mTFP1的光谱指纹到解混信道（ 图3中 ，箭头-2）。
3. 设置的激发激光回458纳米氩源。
4. 放置60X油浸物镜上面的Nesprin-TS观看菜。
5. 聚焦在荧光细胞与足够亮表达后，调整增益和激光功率来优化信噪比。
   注意:由于Nesprin-TS的FRET效率接近20％，未混合的金星图像应比未混合mTFP1图像基本上调光器。一旦可接受的功率和增益设置已被迭代地确定，这些参数必须保持所有的图像恒定上校ured。
6. 捕捉的最小Nesprin-TS细胞的15-20图像具有相对类似的亮度和避免过度像素饱和（饱和的所有像素的图像处理过程中被除去）。
7. 重复使用相同的成像参数Nesprin-HL细胞的图像捕获处理。

6.图像处理和比率的图像分析

1. 使用开源的ImageJ（斐济）软件（http://fiji.sc/），使用BioFormats Reader中打开本机格式的图像。
2. 前处理的图像，并计算使用先前建立的方案¹⁵的比率的图像。

结果

按照上述协议，质粒DNA从DNA库中获取并转化入大肠杆菌细胞中。表达该传感器DNA 的大肠杆菌从LB /氨苄青霉素平板上选择并在液体LB肉汤扩增。以下载体的扩增，DNA质粒使用标准，市售的DNA提取试剂盒纯化为TRIS-EDTA缓冲液中。使用分光光度计，纯化的DNA被量化为微克/毫升（ 图1A，1-2天）的标准浓度。

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讨论

一种方法和跨Nesprin-2G，在核LINC复合体的蛋白质的机械张力的活细胞成像演示，在上面概述的。在此之前的工作，各种技术，如微吸管，磁珠术和显微激光烧蚀，已经被用于对细胞核申请应变，并测量它的体积的材料特性^{16，17，18。} 然而，直到我们最近的工作，还没有研究已经直接表明拉力在活细胞中²

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658