瞬时转染293T细胞复制缺陷型逆转录病毒生产

摘要

这种技术演示了一个有效的方式来准备复制缺陷型逆转录病毒编码的人类癌基因的股票，随后诱导骨髓增殖性疾病的小鼠模型中使用。

摘要

我们的实验室研究人类Bcr - Abl的或生长因子受体产生的致癌基因（ZNF198 - FGFR1的，BCR -PDGFRα等）等癌基因诱导骨髓增生性疾病。我们能够在我们的小鼠模型，以模型和研究一个与人类类似的的疾病，以前与利益表达的原癌基因的逆转录病毒感染的骨髓细胞移植。复制缺陷的逆转录病毒编码的人类癌基因和标记（GFP，RFP，耐抗生素基因等）是产生一个瞬时转染293T细胞，腺病毒E1A基因产品转化一个人的肾上皮细胞系的协议。 293细胞有高度磷酸三钙（投诉警察课_4）转染不同寻常的特性，容易达到50-80％的转染效率。在这里，我们共同利益和质粒表达GAG - POL - ENV包装的功能，如包装构造吉或PCL，在这种情况下的单基因质粒EcoPak，的原癌基因表达逆转录病毒载体转染293细胞。最初的转染，进一步提高使用氯喹。 ecotropic病毒的股票，收集培养上清48小时。转染后，可以储存在-80 ° C和用于感染细胞系，改造和体外研究，或小鼠骨髓细胞如原代细胞，在我们的小鼠模型，然后可以用于移植。

研究方案

1. 改造，板3 - 5X10 ⁶细胞/ 6厘米的组织cultureplate 293T细胞前的晚上。
   
   注：我们使用易于转染和efficacyas病毒产生细胞的293T细胞 。 这些细胞是缺乏包装病毒的，除非引入一个辅助质粒。
   
   
2. 第一天上午，轻轻取出介质替换为4毫升293T细胞MED含有氯喹25毫米。培养箱中培养1小时。
   
   注：板应在80％左右融合。
   
   
3. 同时，病毒混合2板准备的时间，在5毫升管：
   1. 2 × 10毫克逆转录病毒质粒的构建
   2. 2 × 5毫克的包装构造（EcoPak）
   3. 2 × 62毫升氯化钙
   4. 完成至1 ml，用无菌_{DDH 2} O
      
      注：虽然逆转录病毒质粒编码的兴趣和标记的癌基因，EcoPak编码GAG - POL - ENV。 连同293T细胞时，就会产生ecotropic逆转录病毒（RV）的特定的小鼠细胞，但不会对人体细胞的感染 。 氯喹和氯化钙₂已被证明能增加转染效率。
      
      
4. 添加2X sterileHBS1毫升下降明智的混合物，一边轻轻振荡管。
5. 立即加入该解决方案2板，每1毫升，轻轻地，一滴一滴。
6. 培养箱中培养7至11小时。
7. 在今晚（7日至11小时以后），轻轻取出介质，轻轻地取代用5毫升的新鲜293T中等。培养箱中培养，直到中午，第二天。
   
   注：这一步很重要，因为你需要从细胞中的氯喹起飞。如果长时间保存，氯是有毒的。在板块的解决方案看起来很模糊，由于非常精细，尘埃状沉淀转染混合物。
   
   
   注：重要的是做极端温柔的所有媒体的变化，细胞已致敏的氯喹，可以很容易地脱离板 。
   
   
8. 第二天，18至24小时。检索病毒（约中午）之前，轻轻取出介质，非常轻柔3毫升新鲜293T中型取代。替换在孵化器的O / N。
9. 第三天早上（18至24小时。以后），轻轻吸了10毫升注射器配有一个18 G针中期形成的板块。这上清包含的逆转录病毒。
10. 更改针到45毫米的注射器过滤器，倒置注射器多次组合的解决方案，通过过滤上清液，cryotubes等分
    
    注：此外，如果你正在为5 0 ml锥形管3 +病毒，池中所有相同的病毒上清板块。拌匀，然后分装上清含有cryotubes逆转录病毒过滤。
    
    
11. 管含有病毒的全上清保存在-80℃直至使用。

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讨论

四个关键点，将保证一个良好的病毒股票的成功：

1. 生产的293T细胞很健康，这意味着他们已经非常有规律的时间表上的分裂，从来没有杂草丛生，并在组织培养板，每6厘米的3.5-5万的优化密度镀，使他们达到一个密度80％的板转染上午。
   
2. 此外氯喹，提高转染效率和随后的病毒滴度，约3 - 5倍，稳定细胞lysozomes和增加到达细胞核内的DNA的一小部分。丁酸钠（另一种溶酶体稳定）也被用于这一...

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材料