简单的力量:海胆胚胎作为<em&gt;体内</em&gt;对于研究复杂的细胞与细胞间信号传导网络交互开发模式

摘要

这个视频文章详细描述了可用于系统地和有效地描述在许多脊椎动物胚胎复杂的信号通路和调控网络的组件的体内方法直截了当。

摘要

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

引言

基因调控网络（GRNS）和信号转导途径建立胚胎发育过程中的基因被用于构建成年动物体计划的空间和时间表达。细胞至细胞的信号转导途径是这些调控网络的基本组成部分，提供了由该小区进行通信的装置。这些细胞相互作用建立和胚胎^1,2中提炼的和之间的各种地区管理和分化的基因的表达。分泌细胞外调制器（配体，拮抗剂），受体和共受体之间的相互作用控制的信号转导途径的活性。细胞内分子的各种各样转导导致改变的基因表达，分裂，和/或形状的小区的这些输入。虽然许多在主要途径在细胞外和细胞内水平所使用的关键分子是公知的，它是由于在很大程度上各个信号通路的复杂性的不完整的知识。此外，不同的信号传导途径常常彼此正或负的细胞外，细胞内相互作用或者，和转录水平^{3，4，5，6。}重要的是，信号转导通路的核心组件是高度保守的所有后生动物物种，并且，显着地，大部分的主要信号传导途径经常在许多物种中特定比较从密切相关的生物门生物体时执行类似的发展功能^{7，8，9， 10，11。}

在开发过程中的信令的研究是在任何生物一个艰巨的任务，并有是在大多数后口模型（脊椎动物，无脊椎动物脊索动物，半索动物和棘皮）学习信号通路几个显著挑战:1）在脊椎动物中有大量的可能的配体和受体/共同调制的相互作用，细胞内的转导分子，以及由于基因组^12，13，14的复杂性不同的信号通路之间潜在的相互作用; 2）配合物的形态和形态发生的运动在脊椎动物常常使其更难以解释在与信号转导途径之间的功能相互作用; 3）在多数非棘皮动物脊椎动物后口模型物种分析由孕的短窗口具有一些被囊动物物种^15,16的异常的限制。

该海胆胚胎具有几个上述限制并提供了许多独特的品质在体内进行信号转导途径的详细分析。这些包括如下:1）在海胆基因组的相对简单显著减少了可能的配体，受体/共受体和细胞内转导分子的数量的相互作用^17; 2）控制胚层和主要胚胎轴的说明书和构图的GRNS被很好地建立在海胆的胚胎，在细胞/地区的调节上下文的帮助理解接收的信号^18，19; 3）许多信号转导通路可以早期卵裂和原肠阶段之间，当胚胎是由单层上皮细胞的形态比较容易分析进行研究; 4）涉及的分子d。在信令海胆很容易操纵的途径; 5）很多海胆都妊娠一年（ 如紫色球海胆和Lytechinus 10 斑叶至11个月）。

在这里，我们提出了一个方法，系统地，高效地刻画指定和海胆胚胎模式的领土，说明这几个无脊椎动物模型系统在复杂的分子机制研究提供了优势的信号通路的组成部分。

研究方案

1.高通量吗啉设计策略

1. 鉴定感兴趣的基因（多个）（ 例如 ，候选基因的方法，顺式调控分析，RNA测序和/或蛋白质组差动屏幕）。
2. 使用基因组，转录组和可用的基因表达数据上经常更新的网站（ 如 SpBase http://www.echinobase.org ²⁰和S紫石基因搜寻的http:///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index html的），以确定的时空表达谱与所讨论的发育机制重叠。如果没有表达数据是可用的，然后生成的qPCR引物和/ 或原位探针的反义来评估基因表达模式。
3. 确定的空间和时间表达模式之后，获取从基因组网站的DNA序列。
   1. 为了生成翻译阻断吗啉代寡核苷酸序列获得ØF中的5'未翻译的区域（5'非编码区）直接上游上SpBase或S.紫石基因组搜索网站提供表达序列标签（EST）数据库起始密码子。如果此信息是用于感兴趣的基因不可用，则执行5'RACE。
   2. 要设计一个剪接阻塞吗啉，搜索包括外显子和使用SpBase或S.紫石基因组搜索工具脚手架BLASTN工具内含子的基因组序列。
4. 使用该寡核苷酸设计网站http://oligodesign.gene-tools.com以设计所需的25个碱基对吗啉代序列。
   1. 对于平移阻挡吗啉，使用mRNA序列从5'到3'为平移靶序列的来源。包括5'非编码区序列（约70个核苷酸的转录起始位点的上游）加上起始密码子标记的Wi编码区（起始位点的下游）的25个碱基第括号（ATG）。
   2. 对于拼接阻塞吗啉代，选择内含子 - 外显子或外显子 - 内含子边界序列，并包括50个碱基（外显子序列的25基地和内含子序列的25个碱基）的边界区域周围。扫描具有吗啉代序列的基因组中，以验证该序列是唯一的。

2，吗啉寡聚核苷酸显微注射

1. 通过加入100微升不含核酸酶的水进入300纳摩尔啉小瓶制备吗啉代寡核苷酸的3 1mM储备溶液。
   注:请不要使用DEPC处理过的水的再悬浮，因为焦碳酸二乙酯会损坏吗啉。
2. 用于第一重构降速含有30秒全速股票寡核苷酸溶液的管形瓶（14000 - 16000 XG），简要地涡旋，热在65℃下进行5至10分钟，短暂涡旋，并保持啉库存在室温温度下至少1小时。吗啉原液 s的-20℃贮存至+4℃。
3. 制备含有吗啉代寡核苷酸以所需浓度注射溶液。该溶液通常含有20％的甘油或125毫米氯化钾作为载体和15％FITC-葡聚糖（异硫氰酸荧光素葡聚糖的10,000MW 2.5毫克/μl原液）。 FITC-葡聚糖和其他荧光葡聚糖偶联物通常用于通过荧光显微镜，以确定注射的胚胎。在-20℃储存注射液。
4. 热在热块或水浴至少2在65℃的吗啉溶液 - 5分钟。
5. 旋转简要30秒全速啉溶液（14000 - 16000 XG）全速1分钟，离心机，混匀（14000 - 16000 XG）至少10分钟。
6. 负载啉溶液注射针。有关详细显微注射的协议，请参阅Stepicheva，宋，2014年²¹和欢呼声和Ettensohn，2004年"> 22。

3.固定和原位协议在紫石S.胚胎24小时受精后（HPF）

注:此协议从阿里纳斯-梅纳等进行修改。 2000年²³塞西等。 ，2014年^24。

1. 固定术
   1. 加入数滴固定液（见下文），含胚胎的井，用移液器轻轻混匀，并允许他们定居。除去固定液，然后用固定剂的两个附加180微升洗涤液混合胚胎。
      注意:对胚胎轻柔吹打向上和向下几次洗涤液中调匀是很重要的。 如果不这样做可以降低信噪比。
   2. 离开胚胎在第二固定剂洗涤50分钟到1小时，在室温（RT）下在4％的电子显微级低聚甲醛组成的10mM MOPS pH为7.0的修正，0.1％吐温-20，以及人工seawateR（ASW）。让每次最好的结果该解决方案新鲜。此外，为了便于和实用的胚胎被固定在96孔板中。
      1. 为20毫升固定剂使用5毫升16％的多聚甲醛，15毫升ASW，200微升的1M MOPS pH为7.0和20微升吐温20。
   3. 在RT洗5次具有MOPS 180微升洗涤缓冲液由0.1M的MOPS pH为7.0，0.5M NaCl和0.1％Tween-20的至少5分钟或直至胚胎下降到井的底部。再次，要彻底轻轻吹打上下数次胚胎到洗涤缓冲混合是很重要的。 MOPS洗涤缓冲液可用于2天，如果保存在4 C。
      1. 为40毫升的MOPS洗涤缓冲液使用4毫升的1M MOPS pH 7.0的，4毫升5M的氯化钠，32毫升的dh ₂ O和40微升吐温20。
      2. 固定的胚胎可以保存在^4℃下2天。
         注意:如果存储固定胚胎长，再加入0.2％的叠氮化钠在MOPS洗涤缓冲以防止细菌滋生。
2. 预杂交
   1. 吸出MOPS洗涤缓冲，并添加2 180微升:MOPS的1比洗涤缓冲到杂交缓冲液中，胚胎混合到通过温和移液几次该溶液中，并在室温下孵育至少20分钟。杂交缓冲液由70％的甲酰胺，0.1M MOPS pH为7.0，0.5M的NaCl，1mg / mL的BSA和0.1％吐温-20。
      1. 对于40毫升杂交缓冲液使用4毫升的1M MOPS pH为7.0，4毫升5 M氯化钠，4毫升的dh ₂ O，0.04克BSA和40微升吐温20。涡旋拌匀，再次添加28毫升甲酰胺和旋涡。
   2. 取出2:1的比例的MOPS洗和杂交缓冲液，并添加1 180微升:2的比例MOPS的洗涤缓冲至杂交缓冲液，胚胎混合到该溶液中，并在室温下孵育至少20分钟。
   3. 之前探针杂交胚胎轻轻拌匀成100 - 150微升杂交缓冲液。在50℃下孵育胚胎至少1H。
      注:隔夜孵化的胚胎是可以接受的。孵育前，密封件用粘合剂片材的孔中，以防止蒸发。
3. 杂交
   1. 轻轻0.3纳克/微升探针和500微克/毫升酵母tRNA到杂交缓冲液中，然后涡旋创建探针溶液 - 在一个单独的试管中加入0.1。酵母tRNA加到探针溶液以降低非特异性反义探针的结合。预热该溶液至50℃，并吸出杂交缓冲液。
   2. 混合预杂交胚入100微升探针溶液中，用粘合剂片材密封，并在50℃下杂交为取决于探头2至7天（foxq2探针可以温育2天）。
      注意:孵育时间将因关闭探头。在低水平表达的一些基因需要长达7天的潜伏期。 96孔板可以被放置在一个恒温恒湿箱作为投保蒸发如果adhes香港专业教育学院表无法正确密封。
   3. 在50℃下用新鲜的MOPS的180微升洗5次洗涤缓冲液，共3小时。然后，洗3次（15分钟）与180 MOPS的微升在RT洗涤缓冲液。请记住混合胚胎入洗轻轻吹打几次，每次缓冲区。
4. 抗体孵育
   1. 吸出MOPS洗涤缓冲液和在180微升封闭缓冲液由10％正常羊血清和5毫克的混合胚胎/ mL BSA的在MOPS洗涤缓冲液和在室温下孵育至少45分钟或4℃过夜。
   2. 除去封闭缓冲液，然后胚胎混入阻断含有1缓冲液:碱性磷酸酶缀合的抗洋地黄毒苷抗体的1500稀释在封闭缓冲液稀释。孵育在室温过夜，在密封板以避免蒸发。注意:不要离开不是一蹴而就更长的抗体。
   3. 洗胚胎6次（5分钟或直到胚胎掉落）在MOPS在室温洗涤缓冲液。胚可以在4℃下过夜贮存。
5. 原位发展
   1. 在RT洗胚胎3次（10分钟）用由的0.1M Tris pH值9.5，100mM NaCl的50 mM的_氯化镁 ，1mM的左旋咪唑新鲜制备的pH 9.5缓冲液和0.1％吐温-20。
      1. 20毫升的pH 9.5缓冲用2毫升的1M Tris pH值9.5，400微升5M氯化钠，1毫升的1摩尔_氯化镁 ，20微升吐温20，16.6毫升卫生署₂ O和0.0048克左旋咪唑。
   2. 孵育在37℃的胚胎在避光染色缓冲液。染色缓冲液由10％的二甲基甲酰胺，4.5微升/毫升4-硝基蓝四唑氯化物（NBT），和3.5微升/毫升的新鲜制备的pH 9.5缓冲5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP） 。
      1. 为1毫升染色缓冲液使用100微升二甲基甲酰胺，4.5微升的NBT和3.5微升BCIP。
   3. 通过在MOPS洗涤3至5次停止碱性磷酸酶反应洗涤缓冲液。反应无线个所述foxq2探针通常需要30分钟至1小时。有些探头可在Rt或4℃需要过夜培养。
   4. 混合胚胎成70％的MOPS洗涤和30％甘油的溶液。甘油提供必要的显微镜的折射率。胚胎可以存储在该溶液中几个星期。密封塑料石蜡板，以防止水分蒸发。
6. 玻片制备和图像捕获
   1. 通过设置双面胶带的三个小条与条之间的小间隙上的滑动三角形制备的幻灯片。
   2. 转移在70％MOPS洗涤和30％的甘油溶液中的胚胎的三角形的中心，并用盖玻片覆盖。
   3. 周围盖玻片边缘运用指甲油一层密封盖玻片。
   4. 捕获使用复合光显微镜20倍的目标和一个附加的摄像机图像。

结果

在海胆胚胎我们已经表明，3种不同的Wnt信号分支（的Wnt /β-catenin的，Wnt基因/ JNK，和Wnt / ^PKC）4，25相互作用形成在管辖前后（AP）的图案形成一个Wnt信号网络。其中的一个信号事件的最重要的结果是，初始广泛表达前神经外胚层（ANE）GRN变得由原肠胚形成的开始（24高倍视野在S紫石 ）限制到周围的前极小领土。这些结果?...

讨论

这里介绍的方法是..许多实验室正在早期海胆发育期间使用类似测定解剖示出使用胚胎与基因组和形态比脊椎动物复杂较少了解信号转导途径和GRNS理事基本发育机制的功率的一例信令涉及其他细胞命运规范事件的途径（ 如缺口，刺猬，TGF-β和FGF信号^{）27，28，29，30，31。}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G