野生类型阻止PCR结合直接测序作为低频体细胞突变的检测的高灵敏度的方法

摘要

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

摘要

治疗后评估残留病时，筛选治疗期间出现的抗性突变精确检测和低频突变的鉴定可能是有问题时，或者当患者有几个循环肿瘤细胞。野生型阻断PCR，接着测序分析提供了高灵敏度，灵活性和简单性作为用于检测这些低频突变的方法。通过加入设计锁核酸寡核苷酸到一个新的或先前建立的常规的基于PCR的测序测定法自定义，在1,000 WT等位基因背景大约1突变等位基因的灵敏度，可以实现（1:1,000）。与脱氨事件相关联的伪影的测序在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中发现可以部分地通过使用尿嘧啶DNA糖基化酶的过程中提取步骤补救。这里的优化的协议是特定用于检测MYD88突变，但可以作为一个模板来设计任何WTB-PCR测定。的WTB-PCR测定相对于其他常用的测定法，用于检测低频突变，包括等位基因特异性PCR和实时定量PCR包括假阳性的发生较少，更大的灵活性和易于实施的优点，并同时检测已知的能力和未知的突变。

引言

Sanger测序传统上一直是测试已知和未知的体细胞突变的金标准。一个Sanger测序的局限性是其检测极限（〜10 -在WT的背景20％突变等位基因^）1。灵敏度的这个水平是不合适的检测低的水平的体细胞突变可存在于样品从癌前组织或患者几个循环肿瘤细胞，或当骨髓（BM）是片状。这也使得评估治疗后残留病或由单独²常规测序疗法难以期间检测新兴的抗性突变。通过与锁核酸（LNA）代替传统的PCR介导的野生型在Sanger测序阻断PCR（WTB-PCR），在WT的背景高达0.1％的突变体等位基因的灵敏度，可以实现^2，3，4。在（ - 14 NT〜10）阻塞（LNA）的寡核苷酸优先结合WT DNA的DNA WT从而防止扩增WTB-PCR，富集突变体等位基因是通过添加短来实现的。然后将突变体富集WTB-PCR产物进行测序。通过阻断WT DNA，而不是选择用于特定突变WTB-PCR允许存在于分钟的细胞级分的已知和未知突变富集。

多种方法目前用于在小小区的级分检测突变。这包括等位基因特异性PCR，扩增的受阻突变系统（ARMS），变性高效液相色谱（DHPLC），小珠，乳液，放大，和磁性（整经），电场诱导释放和测量（EFIRM），高分辨率熔点等。然而，这些方法大多是由假阳性，并仅检测试验的目的是为⁴个突变的能力有限。 WTB-PCR，但是，允许用户可视化测序痕迹使多个突变类型的检测，并且可以在排除由于伪像或脱氨基事件误报帮助。下一代测序（NGS）可以提供一个合适的替代常规测序，但是，显着更大的成本，复杂性和较长测定时间使其对于许多疾病类型的几个不同的分子标记物或用于监测患者对治疗的新兴的不必要的选项耐药性突变。具有小于5％的突变体等位基因频率。此外，当检测到高的假阳性率变体可造成问题对于基于扩增子-NGS ^5,6。

在这里，我们证明在由WTB-PCR在通过Albitar 等人描述筛选在髓样分化因子88基因的突变来实现灵敏度的增加。 ³ MYD88 mutatioNS是在华氏巨球蛋白血症（WM）未知的意义（IGM-MGUS）的，IgM单克隆丙种球蛋白病，脾边缘区淋巴瘤（SMZL）重要的诊断和预后因素，和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。 MYD88突变在几乎所有情况下的WM和患者的免疫球蛋白M（IgM抗体）分泌型MGUS约50％的发现。与此相反，MYD88突变仅在0-6％的患者SMZL发现是多发性骨髓瘤^7，8缺席。因为重叠形态学，免疫表型，细胞遗传学，和WM和SMZL或IgM多发性骨髓瘤通常可以鉴别诊断复杂之间临床特点，一个MYD88突变的存在可作为一种有用的鉴定因子^9。 MYD88突变也与较大的疾病负担在DLBCL患者和总生存期差治疗后⁷相关^{， 10。}此外，因为MYD88突变在活化的B细胞样（ABC）DLBCL比更频繁地发现生发中心B细胞样（GCB）DLBCL或原发性纵隔B细胞淋巴瘤（PMBL），MYD88突变状态可以用作替代标记为ABC亚型^11,12。

这里提供的详细协议用作从该新测定法可以开发或大多数现有的测序测定法可以容易地适合于准确地检测各种样品类型低频突变的模板。该方法也可用于监测和检测可能在肿瘤中或甚至同时患者正在与靶向治疗或抗生素治疗可能发展细菌发展抗性突变。此外，它解决和补救许多与突变富集特别是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织相关的问题。

研究方案

伦理声明:获得机构审查委员会（IRB）的批准后进行人体样品所有测试。

1. DNA的提取FFPE组织，外周血和骨髓吸

1. 对于DNA FFPE提取试剂盒骨髓FFPE组织
   1. 与来自未染色的载玻片FFPE组织开始（5 - 5 10部分 - 10微米厚）。
      注意:如果开始与组织屑，使用3 - 6个切片在5 - 10微米厚，并跳到步骤1.1.6。
   2. 放置在滑动的滑动篮和制备四种洗涤储层（两个用于二甲苯和两个100％酒精）。添加600毫升的溶液，以每笼最小体积。
   3. 通过执行在第一托盘上的5分钟洗涤二甲苯Deparaffinize幻灯片。转移滑动到第二二甲苯洗蓄水池额外的5分钟。
   4. 脱石蜡后，洗净，用100％乙醇将载玻片5分钟。转移的幻灯片第二醇洗蓄水池额外的5分钟。
   5. 允许的幻灯片用刀片刮他们入微量离心管中之前，罩下完全干燥。
      注意:如果与肿瘤区域的H＆E滑动指示是可用的，对准的幻灯片并刮去仅肿瘤区域。
   6. 从制造商讲义包括在试剂盒说明书进行。
2. 对于BM吸出物和外周血
   1. 根据制造商的说明施舍这些规范提取。
      注:有许多市售试剂盒，并从FFPE组织和细胞中的DNA提取方法。实际上，所有的都可以使用。使用是建立在实验室的方法。
      1. 使用200μL的外周血（PB）或100μL的BM + 100μLPBS。
      2. 使用4μL核糖核酸酶A原液。
      3. 用100微升洗脱缓冲液洗脱。
3. DNA定量
   1. 测量使用分光光度计确保约1.8的260 / 280nm光比（纯DNA）的DNA浓度。如果该比率低明显，它可以指示蛋白质，苯酚或其他污染物的存在可与下游应用干扰。
   2. 调节DNA浓度至约50 - 100纳克/μL与适当的洗脱缓冲液。

2.野生型阻断PCR

1. 引物设计
   1. 对于根据以前感兴趣的基因设计引物，获得描述PCR引物设计¹³的一般准则。包括M13正向和反向PCR引物通用测序引物。
      注:MYD88测定的开发是为了扩增MYD88的外显子5（G259 - N291）和110个核苷酸位于5' 内含子区域，以覆盖内含子4向前的剪接位点和部分和反向引物被设计具有5' -M13序列（M13正向:TGT AAA ACG ACG GCC AGT; M13反向:CAG GAA ACA GCT ATG ACC）以允许互补的测序引物退火（见材料表 ）。
2. 锁核酸寡核苷酸设计
   1. 设计阻断寡核苷酸为大约10 - 的长度为15个碱基并互补于其中突变体富集所需WT模板。
      注:较短的寡核苷酸将提高不匹配歧视。为了实现高目标专一，不要使用过多的阻挡核苷酸，因为这可能会导致一个非常"粘"寡核苷酸是很重要的。的内容和长度以及阻断核苷酸应该根据需要被阻挡的特定核苷酸进行优化。实现高结合特异性不影响二次结构和冒着自身互补性是很重要的。
   2. 设计阻断寡核苷酸具有的_Tm 10 - 15℃的延伸TEMPERAT上述热循环过程中URE。阻断G或C碱基的- （4个碱基3）通过添加或移除阻塞碱或通过用于DNA代阻断碱基同时避免长段调整的_Tm。
      1. 导航到寡工具网站（见材料表 ），然后选择"阻断寡核苷酸TM预测"的工具。
      2. 粘贴期望被阻止进入"寡序列"框中的WT模板的序列。添加"+"在基地前，表示拦截基地。
      3. 选择"计算"按钮，以确定DNA阻滞剂混合的近似的_Tm。
   3. 设计阻断寡核苷酸，以避免二级结构的形成或自二聚体。
      1. 导航到寡工具网站（见材料表 ），然后选择"阻断寡核苷酸优化"工具。
      2. 粘贴期望被阻止进入所述箱WT模板的序列。添加"+"在基地前，表示阻止基地。
      3. 选择"二级结构"和"自我，只有"两个盒子。按分析按钮审查潜在麻烦的二级结构或自二聚体寡。
         注:分数代表在T _M"的二级结构和自二聚体第非常粗略的估计。得分较低，因此最佳的，并且可以通过限制阻断受体阻滞剂配对来实现。对于MYD88 [MYD88blocker（TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /）]被设计为覆盖氨基酸Q262-I266，并设有一个3'-反转的阻断寡核苷酸的dT同时抑制由延伸DNA聚合酶和降解3'-核酸外切酶。这个特定的阻断寡核苷酸是与被表示为"+ N" 10个阻断碱基的17聚体。剩余的7个碱基是普通DNA核苷酸。
3. WTB-PCR设置和热循环
   1. 准备WTB-PCR主设备MiX（MMX）使用2.5μLPCR反应缓冲液10倍重量/ 20毫摩尔MgCl _2，250倍μM的dNTP，0.2μM的正向和反向引物，1.2μMMYD88blocker，和DNA酶，不含RNA酶的，超纯H ₂ O操作产生最终溶液体积的每个反应21.75μL。
      注:工作浓度为25μL的最终反应体积（加入DNA模板和聚合酶之后）。常规PCR MMX是通过简单地省略除了阻断剂制备。所有协议步骤保持两者WTB和常规PCR相同。这可以验证使用，并确定富集加入阻滞剂的实现。
      1. 当计算MMX的量，以制备确保考虑到3个额外的反应（阳性和阴性对照和非模板对照检查污染）和移液误差至少1个另外的反应。
   2. 涡MMX彻底。的MMX可以储存在-80℃下长达着y耳。
   3. 添加每反应0.25μLTaq DNA聚合酶到MMX和反转混合。一旦聚合酶被添加到MMX，保持它在冰上。
   4. 把一个新的96孔PCR板上的冷板和移液管的MMX 22μL用聚合酶到每个反应孔。
   5. 加入3微升基因组DNA（50 - 100毫微克/微升到各自包含MMX聚合酶孔中。
   6. 将板密封并短暂离心以确保溶液达到各孔的底部。
   7. 加载热循环仪上的PCR板。
      1. 在95℃下进行6分钟初始变性;:设置WTB-PCR反应的热循环条件如下在95℃下变性30秒，引物退火在56℃下进行30秒，和延伸72℃1分钟20秒的40个循环;在72℃下最终延伸10分钟。
         注:最佳实践包括完成在物理上分离的区域中的所述协议的其余部分，以避免扩增子污染我ñ未来设置。
4. 根据先前描述的方案¹⁴以确定是否WTB-PCR成功，并确认在非模板对照缺乏扩增进行凝胶电泳。
5. 通过磁珠PCR产物的纯化
   1. 从4℃除去磁珠并使其达到室温。
   2. 转移到新的PCR板10μL的PCR产物。
   3. 涡磁珠大力完全悬浮的磁性粒子。
   4. 加入18微升磁珠，每孔上的新盘。移液器混合10倍。
   5. 在室温下孵育5分钟。
   6. 放置PCR板到侧裙边磁铁板2分钟，以从溶液中分离磁珠。
   7. 吸出上清液用多道移液器，避免了珠粒料。
   8. 分配150μL70％乙醇到每个孔中并在室温下孵育FOř至少30秒。吸用多道移液器乙醇和丢弃的提示。重复这一清洗过程一次。
   9. 使用20μL的多道移液器吸从每个剩余的乙醇井并丢弃提示。
   10. 一旦井干燥（〜10分钟），从磁铁板除去和无核酸酶的水加入40μL到各孔中，移液管混合15倍或轻轻涡旋。
   11. 在室温下孵育2分钟。
   12. 放置PCR板到磁铁板1分钟以从溶液中分离磁珠。
   13. 转移35微升纯化的产物，以一个新的PCR板。这是现在纯化的PCR产物准备与双向测序继续或直到需要可以在-20℃保存。
       注意:当开发一种新的测定法中，可能需要纯化的PCR产物的定量。 1 - 3纳克/μLDNA扩增子是最优的双向测序。如果浓度一直很低，增加PCR产物和磁珠比例onally（1:1.8）。如果浓度是一致的高，洗脱用的水更大的体积。

3. WTB-PCR产物的测序

1. 双向测序
   注意:下面的协议是已经过优化以使用较少的试剂制造商的说明书的修饰形式。
   1. 准备正向和反向测序反应，用0.25μL现成反应混合物，1.88μL测序缓冲液，1.78μMM13-F或M13-R测序引物和混合添加和DNA酶，不含RNA酶的，超纯H ₂ O操作创建最终的溶液每反应9μL体积。这种测序反应混合物可以储存在-20℃下长达一年。
   2. 吸管9μL正向测序反应混合物成用于前向测序反应新的96孔PCR板的每个孔中的。重复上用于反向测序反应的单独板。
   3. 添加纯化的WTB-PCR产物吨的1μLÒ每个孔上的正向和反向板两者。
   4. 将板密封并短暂离心以确保溶液达到各孔的底部。
   5. 加载热循环仪上的PCR板。
      1. 设置了测序反应的热循环条件如下:96℃1分钟;的96℃30个循环保持10秒，50℃5秒，60℃4分钟;保持在4℃下，直到准备用于纯化。
2. 净化测序产品
   1. 制备的3M乙酸钠（pH 5.2）和100％乙醇中的新鲜1:25溶液。
   2. 制备新鲜的70％乙醇溶液。
   3. 添加乙酸钠30μL/ 100％乙醇溶液以正向和反向测序板和移液管混合5倍的各孔中。
   4. 重新密封板并在室温下在黑暗中孵育20分钟。
   5. 离心板在2250×g离心15分钟。
   6. 移开板盖和倒置在浪费容器。
      注:反转只有一次或颗粒可以从孔底部松动。
   7. 放置在干净的纸巾和离心机反相板在150×g离心1分钟。
   8. 150μL的70％乙醇添加到每个孔中。
   9. 重新密封板和旋转在2250×g离心5分钟。
   10. 重复步骤3.2.6和3.2.7。
   11. 如果井没有完全干透，让他们风干在室温下。确保样品从光，而干燥的保护。
   12. 加入10微升甲酰胺，每孔和吸管搭配10倍。重新密封板。
   13. 变性上热循环仪在95℃下进行3分钟，随后4℃5分钟。
   14. 变性后，根据制造商的说明¹⁵替换测序平台与隔膜和顺序板盖。

4.测序结果分析

1. 使用测序DAT可视化测序踪迹根据制造商的说明¹⁶和对准相应的参考序列的分析软件。对齐MYD88到NCBI参考序列"NM_002468"。

结果

延伸期间WTB-PCR的概念的概述示于图1。因为在阻滞剂-DNA杂交的单个核苷酸错配大幅降低其熔化温度_（ΔTM = 20 - 30℃）中，WT等位基因的扩增而突变体的模板DNA是免费完成延伸部¹⁷被阻断。以这种方式，而WT DNA线性扩增的突变的DNA指数扩增。

由WTB-PCR获得的突变体富集的示范显示在图2。...

讨论

这里所描述的WTB-PCR测定法使用与设计的延伸部（ 图1）期间阻断WT DNA的扩增阻断寡核苷酸的通用引物组。然后将WTB-PCR产物测序突变分析。 WTB-PCR /桑格的效用在于它的简单性，高灵敏度，以及高通量。使用此处描述的准则，大多数现有的基于桑格测定可简单地通过加入阻断寡核苷酸，大大提高了灵敏度的修改。在这里介绍的例子测定中添加单一阻断寡核苷酸进行PCR的增加的检测的从约...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL)	Roche	12032937001	With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~ 1,000 mL
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade