方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用

摘要

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

摘要

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

引言

在医学研究中，许多注意力集中在膜蛋白，无论是内在的或外在的，参与多种脂质的相互作用。与脂相互作用的蛋白质的工作包括任一选择的替代给脂质，如清洁剂，amphipols ^1，或小蛋白质^2，或发现的膜替代，保持该蛋白的可溶性和活性。硫辛酸膜替代品包括脂质体和纳米圆盘^{（ND）3,4。}

纳米圆盘是通过改造蛋白的一部分，载脂蛋白A-1，高密度脂蛋白（HDL）在血液天然存在的开发近天然膜的平台。载脂蛋白A-1是243残留长的短的两亲性α螺旋链，并有一个免费的脂溶性构象。 在体外 ，当在脂质的存在下，蛋白质的ApoA-1的两个副本自发重新排列以环绕HYDR脂质双层补丁⁵ ophobic酰基链部。的ApoA-1的工程化的版本通常被称为膜支架蛋白（MSP），以及越来越多的是可商购的质粒或纯化的蛋白质。在⁶较长或较短的⁷膜支架蛋白重复或α螺旋的缺失载脂蛋白A-1的结果。这又使得能够形成大约6毫微米光盘⁷至17纳米的直径⁸英寸有不同类型的用于纳米圆盘^3,9的应用程序。最常用的应用是提供一种完整的膜蛋白⁸的稳定的近天然膜的环境，预先^3,9审查。 A-探索较少使用是为研究提供一个纳米膜表面外周膜蛋白^{10，11，12，13，14，15，16，17。}下面的协议的部分1可视化制备的磷脂和膜支架蛋白组成的纳米圆盘的过程。

样品制备是在大多数方法的瓶颈。具体方法-样品可以添加特定的信息，但它们也使结果的比较困难。因此，它是简单的，当样品是多峰，并且可以在多种不同的方法可直接使用。与使用的纳米圆盘的一个优点是纳米圆盘的相比，脂质体（ 例如，样品可以直接用于两个TEM和非变性凝胶电泳，如在本协议）的小尺寸。

囊泡和脂质体早已被用于了解膜相互作用蛋白的功能。用于结构研究和可视化，一个跨膜蛋白的脂质体的结构确定的一个例子是可用的^18。然而，嵌入脂质体膜中的monotopic膜蛋白没有高分辨率三维结构还没有公开发表，据我们所知。金纳米粒子或抗体可用于显现结合的蛋白质用TEM ¹⁹的脂质体或囊泡。尽管这些探针是非常具体的，它们可能是由光帷的膜结合位点或通过掩模的与柔性部件感兴趣的区域与膜结合蛋白干扰。金标记或抗体 - 复合的蛋白质也许可以在一个凝胶上分析，但是这将增加实验的成本。

虽然脂质体是一个很好的平台，我们不能肯定，流行ulation具有每脂质体蛋白质的特定的比率，可以通过使用纳米圆盘²⁰的探索的特征。在脂质体，辅因子和底物可被截留在水溶性内部。这是膜水溶性物质将共享相同的命运两种膜的模拟物的。尽管如此，由于该双层区域是在纳米圆盘较小，需要物质的量较小以饱和纳米圆盘膜。

通过原子结构的测定蛋白质的认识功能的研究很多领域是必不可少。蛋白质结构测定方法包括X射线^21;核磁共振^{（NMR）22，23;}和透射电子显微镜^（TEM）24在低温下，cryoEM。通过cryoEM分辨率近来有了很大的提高，主要是由于直接使用电子脱离的tectors ^25,26。的大分子在近天然状态下拍摄的薄，玻璃体冰^27。然而，由于生物分子的低对比度，它们变得很难在100的尺寸范围，以检测 - 200 kDa的。为适当大小的样品，数据收集可以制成并且可以应用于单粒子重建的方法，得到结构^28。

然而，蛋白质结构的通过TEM测定是一个多步骤的过程。它通常与样品单分散性的使用负染色TEM ²⁹像^{phosphotungsten（PT）30}或铀³¹重金属盐的评估开始。的负染大分子的低分辨率模型的重构通常制成，并且可以得到在分子结构²⁹的重要信息。在平行下，使用cryoEM可以开始收集数据。应谨慎评估负染色TEM数据时，为了避免假象形成的误解作出。一个特定的人工制品是在PT污点上的磷脂的效果和脂质体^32，从而导致长棒类似，从侧面³³观察硬币堆叠的形成。这种"ROULEAU"或"堆栈"（以下简称记为"堆"）观察早期对HDL ^34，后来还为纳米圆盘中^35。

膜的堆叠和重塑可能有很多原因发生。例如，它可以通过共因素，如铜，通过TEM成像钼酸铵染色³⁶所示来诱导。膜脂质的脂质体的部分含有一个亚氨基二乙酸头组用EDTA模仿金属络合，从而在加入铜离子后堆叠脂质体 36。堆叠也可能是由于在或在脂质双层通过的蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用（使用的染色未提及^）37。观察到初期由PT磷脂的叠层形成;然而，后来的工作重点是拆除或取消此神器形成^38。

在这里，我们建议采取NAPT诱导纳米圆盘堆叠的膜结合蛋白的透射电镜研究优势的方法。总之，蛋白的纳米圆盘结合会阻止纳米圆盘从堆叠。虽然为堆叠的原因尚不清楚，有人提议³⁹存在的磷脂和PT的磷酰基之间的静电相互作用，使光盘粘到彼此（ 图1A）。我们的协议背后的假设是，当一个蛋白结合至纳米圆盘，大部分磷脂表面的不availa竹叶提取用于与PT中的相互作用由于由蛋白质空间位阻。这将防止堆的形成（ 图1B）。两个结论可以得出。首先，预防堆叠意味着感兴趣的蛋白质已结合到膜上。其次，蛋白质- ND复合体可以用标准的单粒子加工方法^24，40被处理，以获得复合物的粗形态。此外，通过像非变性凝胶电泳或动态光散射方法的分析可以被执行。

为了证明这一假设，我们使用的膜结合蛋白5-脂氧合酶（5LO），其涉及许多炎性疾病^41,42。这个78-kDa蛋白需要钙离子结合其膜^43。虽然这种膜协会已被广泛研究使用脂质体S ="外部参照"> ^44，45,46和膜部分^47，这些不能被用于TEM分析和结构确定。

纳米圆盘的制备通过混合脂重新悬浮于胆洗涤剂钠MSP开始。在冰上孵育1小时后，该洗涤剂慢慢地从使用吸附剂树脂重构混合物中除去。这种材料常常由聚苯乙烯形成小珠。他们是相对疏水并有较脂类结合⁴⁸洗涤剂有强烈的偏好。除去疏水珠和使用离心进行澄清后，将纳米圆盘通过尺寸排阻色谱（SEC）纯化。纯化的纳米圆盘与以等摩尔比率（或几个比率滴定）一个monotopic膜蛋白（和可能的辅因子）混合，并留于rEACT（15分钟）。通过TEM分析是通过将样品的微升-量到辉光放电，碳包被的网格，然后通过与NAPT进行负染色进行。从当等分试样施加到TEM格栅上相同的样品可通过非变性或SDS-PAGE凝胶电泳，以及由各种活动的测量可用于分析，没有大的变化。

研究方案

1.纳米圆盘的制备

1. 表达和膜支架蛋白⁸的纯化^，35
   1. 表达在大肠杆菌 BL21的His-标记MSP1E3D1（DE3）中T1R pRARE2应变在烧瓶中。准备与在37℃下补充有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基的50mL过夜起始培养。稀释过夜起始培养在2L补充50微克/毫升卡那霉素了不起的肉汤培养基。
   2. 生长的细胞在37℃，直至在600nm（OD _600）的光密度在18℃达到约3.诱导用0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）为3小时的蛋白的表达。
   3. 制备裂解缓冲液（100mM的Tris-HCl，pH值8.0; 100毫摩尔NaCl; 10％甘油）。临用前加1毫米TCEP。
   4. 在18℃诱导3小时后，收获，离心所述细胞10分钟，在4500 xg离心和4℃。弃去上清液，称重收获的细胞，并在裂解缓冲液以每克细胞的2裂解毫升缓冲液中的比例重新悬浮它们。
   5. 裂解的细胞用脉冲超声处理（重复率:4秒开，4秒OFF）为3分钟，在80％的幅度。
   6. 离心20分钟的裂解物在49000 xg离心和4℃。舍弃这个离心沉淀。
   7. 注入上清液成5毫升镍⁺螯合柱连接到自动化液体色谱系统优选保持在4℃。
   8. 洗脱步骤（步骤1.1.9）之前，洗涤用缓冲液1列 - 3的下方，以除去除了His-标记的MSP的所有蛋白质。监测280nm处跟随纯化过程中的蛋白质含量;在280处的UV记录应该每次洗涤后回到基线。
      1. 的40mM的Tris-HCl，300mM NaCl的10 mM咪唑，和1％的Triton，pH值8.0:用洗涤缓冲液1洗涤。
      2. 40毫米的Tris-HCl，300 MM:用洗涤液洗2的NaCl，20mM的咪唑，和50mM胆酸钠，pH值8.0。
      3. 的40mM的Tris-HCl，300mM NaCl的，​​和50mM咪唑，pH 8.0的:用洗涤缓冲液3洗涤。
   9. 用40mM的Tris-HCl，300mM的NaCl和500mM咪唑，pH 8.0的洗脱MSP。
   10. 改变缓冲器到MSP标准缓冲液（20mM的Tris-HCl，pH值7.5; 100毫摩尔NaCl;和0.5mM EDTA）中通过凝胶过滤^8，35;每批产量应该在7毫克L ^-1。
2. 磷脂原液的制备
   1. 添加1-棕榈酰-2-油酰- SN溶于氯仿-glycero -3-磷酸胆碱（POPC）的305微升以25毫克/毫升到一个玻璃烧杯中的浓度，并通过用氮气缓流吹扫它蒸发氯仿。干燥在真空干燥器脂质过夜。注:执行该步骤以从脂质，留下脂质的薄膜在玻璃烧杯底部除去溶剂。
   2. 悬浮在通过涡旋管，直到溶液变得透明含有100mM胆酸钠的MSP标准缓冲器200微升脂质饼;这将提供具有50毫米的POPC浓度的溶液。
      注意:一般来说，脂质洗涤剂此时的摩尔比应为1:2（脂:清洁剂^）8。此脂质洗涤剂混合物可以储存在-80℃近2个月。
3. 用于洗涤剂除去疏水珠粒制备
   1. 代替5-克珠（干重），在50毫升的管中。
   2. 用30ml 100％的甲醇洗珠，然后用40mL超纯水。
   3. 与MSP毫升10标准缓冲液洗珠。最后，在4℃下用15ml的MSP标准缓冲的存储珠。
4. 纳米圆盘重建
   1. 免除MSP1E3D1（0.124毫米）的190微升到离心管中，加入的磷脂原液（50毫米毫米P 61.5微升OPC），以相同的管中。孵育在湿冰上重构混合物1小时。注意:此等于1的摩尔比:（:POPC MSP1E3D1）130。
   2. 以0.5克每毫升珠粒重构混合物的浓度添加疏水珠以引发自组装过程。孵育在旋转恒温箱中在4℃下16小时。
   3. 温育后，离心在13,000rpm XG 10分钟，4℃以除去沉淀物和聚集体。弃沉淀，并保存上清液。
   4. 平衡的大小排阻层析柱（安装一个自动液相色谱系统上）与MSP标准缓冲液，直到在280nm处的吸光度是稳定的。注入上清液到柱并收集峰级分。
   5. 测量的纳米圆盘的浓度在280nm处的峰的级分。使用MSP1E3D1（ε=29910厘米^-1 M ^-1）的摩尔消光系数为纳米圆盘浓度的计算。注意:每纳米圆盘脂质的数量可以通过放射性标记的脂质和磷酸分析⁴的组合或单独磷酸盐分析来测定。

2.制备Monotopic蛋白5-脂氧合酶³⁵

1. 准备过夜起始培养。补充50毫升，100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基。接种用含有5-脂氧化酶基因（ALOX5）的质粒的大肠杆菌 BL21（DE3）中的介质。稀释过夜起始培养在含有42毫摩尔_的 Na ₂ HPO _4，24毫KH ₂ PO _4，9毫摩尔NaCl，19毫摩尔_氯化铵 ，1mM的MgSO ₄上，0.1毫_氯化钙 ，0.2％D-葡萄糖，0.1表达培养基％，5微米的FeSO _4，和100微克/ mL氨苄青霉素。生长细胞直到OD ₆₀₀为〜0.5，在25℃。在^20℃35诱导蛋白表达用0.2mM的IPTG 16小时。
2. 收获离心在7000 xg离心和4℃10分钟并弃去上清液。称重在含有裂解缓冲液收获细胞，重悬收集的细胞在管的底部的沉淀含有蛋白酶抑制剂和0.5（100毫摩尔Tris-HCL，pH8.0中;和1mM TCEP 100mM NaCl的; 10％甘油）中毫克/毫升³⁵溶菌酶以2mL每克细胞的裂解缓冲液的比例。
3. 裂解在80％振幅的细胞通过超声处理5×15秒。离心10分钟在7000 XG，4℃取出细胞碎片。执行硫酸铵沉淀到30 - 60％的饱和溶液中的^35，以沉淀蛋白质。离心16,000 xg离心15分钟，4℃。注:5LO粒料可以快速冷冻并储存在-80℃下长达6个月。
4. 悬浮用20ml裂解缓冲液和离心分离的沉淀物为以40,000 xg离心15分钟，4℃。
5. 孵育上清在4℃下进行的ATP琼脂糖柱30分钟。用含有0.5M NaCl的裂解缓冲液中的一列体积洗柱一次。洗脱用20mM ATP的5LO在含有10μM的FeSO ₄和20微克/毫升过氧化氢酶的裂解缓冲液。执行凝胶过滤层析以除去ATP的^35。
   注:5LO是不稳定的，应在纯化后立即使用。否则，推荐在硫酸铵沉淀的步骤（见步骤2.1.3后音符）停止。

3.纳米圆盘蛋白复合物的制备

1. 制备100μL的复合物的总体积。拌0.8μMND和0.8μM的5LO与1毫米的Ca ²⁺存在于MSP标准缓冲液（20mM的Tris-HCl，pH值7.5; 100毫摩尔NaCl; 0.5mM EDTA的;和1.5mM的氯化钙_2）和孵育10分钟在冰上。注:样品可以储存在4℃下³⁵至一个月。

样品的ove_title"> 4。分析

1. 凝胶电泳
   1. 非变性电泳
      1. 混合使用装载缓冲液的5微升（50毫BisTris，6当量盐酸，50 mM氯化钠，10％（重量/体积）甘油，和0.001％丽春红，pH值^7.2）49样品15微升并加载在4 - 16％双Tris凝胶电泳执行。
      2. 填充光阴极缓冲阴极罐（50毫双的Tris; 50mM的曲辛，pH值6.8;以及0.002％考马斯G-250），并与运行缓冲液（50mM二的Tris和50mM麦黄酮，PH值6.8）在阳极罐。在150 V.使用恒定电压开始分离
      3. 停止电泳分离时考马斯前沿到达凝胶的末端。
      4. 染色用标准考马斯蓝协议的凝胶。
   2. 变性电泳
      1. 混合样品40微升用含SDS上样缓冲液10微升（0.05％（重量/体积）溴酚蓝;的0.2M的Tris-HCl，pH值6.8; 20％（体积/体积）甘油; 10％（重量/体积）SDS中和10mM 2-巯基乙醇），并加载在4 - 20％的Tris甘氨酸凝胶进行电泳。
      2. 用运行缓冲液填充在阴极和阳极罐（25毫摩尔Tris盐酸，pH值6.8; 200毫甘氨酸;及0.1％（重量/体积）SDS）。在150 V.使用恒定电压开始分离
      3. 停止电泳分离时装载染料前沿到达凝胶的末端。
      4. 染色用标准考马斯蓝协议的凝胶。
2. 的NAPT溶液的制备
   1. 溶解1g盐磷钨酸钠在50毫升水通过搅拌在室温下，得到2％（重量/体积）的酸性溶液。
   2. 将pH调节至7.4，用1M的NaOH。使用0.22微米的注射器过滤器除去颗粒。储存在室温下或4℃的溶液中。
3. 样品的TEM分析的制备
   1. 辉光放电碳包覆铜网格（400目）为20秒，在30 mA到呈现样品的吸附前亲水的网格。放置在网格上的样品（0.8μM相对于所述纳米圆盘）的3.5微升并孵育30秒。注:施加的体积可以变化微升2.5和5之间，这取决于样品浓度。对于纳米圆盘合适的浓度范围为0.5 - 1微米。
   2. 用滤纸吸干多余的解决方案。
   3. 立即染色用2％NAPT的30秒的下降电网。吸去多余的溶液，并离开网格风干。
   4. 评估通过TEM网格。与120-200千电子伏加速电压显微镜足以估计堆积的程度。注:在本协议中，使用了校准的透射电子显微镜，配备了一枚200千电子伏场发射枪。
   5. 记录TEM图像。对于呈现多头堆栈的图像，不进一步处理;图像显示的纳米圆盘的复合物，与外在蛋白可能包含几短栈，但大多数颗粒是在复杂的。记录多个图像和过程中，这些根据标准方法来获得类的平均值和低分辨率，复杂的三维模型。
      注:对于负染色数据的收集，网格被至少在三个不同的日子进行。每一天，涂敷负染色前新鲜样品孵育（如在步骤3.1）中进行。

结果

我们提出的方法，取决于制备纳米圆盘提供monotopic膜蛋白结合膜表面。因为有嵌入到纳米圆盘脂质双层无跨膜蛋白，所述纳米圆盘在这里表示为"空纳米圆盘"（ 图2A）。这些具有256 kDa的计算分子量两个MSP1E3D1骨架蛋白和大约260 POPC ⁸的分子的组合物。使用这种蛋白质:用于重建脂质比，一个主要的峰（ 图2A）的凝胶过滤中洗脱。约9?...

讨论

该方法可以被分为三个部分:空纳米圆盘的重组，制备蛋白质 - 纳米圆盘复合物，以及用于这些配合物的TEM的阴性染色。每个部分将分别关于该技术，关键步骤，和有用的改进的局限性来解决。

空纳米圆盘重建。关键步骤和限制在生产和使用纳米圆盘。

为空的纳米圆盘的制备中，有必要优化MSP与脂质的比例。对于最常见的MSP和脂质（使用胆作为洗涤剂），?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid: POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate			500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock			50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer			20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer			In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer			In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth			Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL. Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.