小鼠主动脉夹层损伤:高效<em&gt;体内</em&gt;平滑肌细胞增殖和内皮功能模型

摘要

心血管手术后的再狭窄（旁路手术，血管成形术或支架置入术）是降低这些手术的耐久性的重大问题。理想的治疗方法是抑制平滑肌细胞（VSMC）的增殖，同时促进内皮的再生。我们描述了同时评估体内VSMC增殖和内皮功能的模型。

摘要

动脉重建，无论是血管成形术还是旁路手术，都涉及医源性创伤，引起内皮细胞破裂和血管平滑肌细胞（VSMC）增殖。常见的小鼠模型研究小血管如颈动脉和股动脉。这里我们描述一种体内系统，其中VSMC增殖和内皮屏障功能可以在大型血管中同时进行评估。我们研究了C57BL / 6小鼠肾下主动脉对损伤的反应。主动脉从左肾静脉到主动脉分叉，用棉花头施放器以5秒持续时间进行30次透壁压迫。用常规组织学评估形态学变化。从腔表面到外膜测量主动脉壁厚度。用DAPI和α-肌动蛋白进行EdU整合和反染色以证明VSMC增殖。激活ERK1 / 2，一种已知的内膜增生形成调节剂是阻止的由Western Blot分析开采。通过B细胞，T细胞和巨噬细胞的免疫组织化学测定炎症的作用。用扫描电子显微镜（SEM）观察内皮的内表面部分。用伊文思蓝染色测定内皮屏障功能。透壁性损伤导致主动脉壁增厚。这种损伤引起VSMC增殖，损伤后3天最突出，ERK1 / 2的早期激活和p27 ^kip1表达降低。损伤不会导致血管壁中增加的B细胞，T细胞或巨噬细胞浸润。损伤导致部分内皮细胞剥蚀和细胞 - 细胞接触丧失。损伤导致内皮屏障功能的显着损失，七天后恢复到基线。小鼠透壁性钝性主动脉损伤模型提供了一种同时研究大血管中VSMC增殖和内皮屏障功能的有效系统。

引言

再狭窄 遵循心血管手术（旁路手术，血管成形术或支架置入术）是降低这些手术的耐久性的重大问题。所有血运重建手术都受到再狭窄的困扰。目前防止再狭窄的策略（药物洗脱支架和药物包衣球囊）抑制血管平滑肌细胞（VSMC）和内皮细胞增殖（EC）。因此，这些干预措施可以预防VSMC介导的再狭窄，而且可以防止内皮细胞的再生。没有完整的内皮，患者需要使用有效的抗血小板药物，以降低出血并发症风险的原位血栓形成的风险。理想的治疗方法是抑制VSMC增殖，同时促进内皮再生。因此，需要同时研究VSMC增殖和内皮屏障功能。

目前来看，再狭窄的小鼠模型¹ 。这些模型包括颈动脉结扎和股动脉线损伤² 。主动脉模型包括支架置入³ ，球囊损伤⁴和主动脉同种异体移植⁵ 。所有目前的型号都是有限的。颈动脉结扎产生流动介导的新生内膜损伤并且不具有内皮损伤。此外，颈动脉和股动脉与人血管相比，细胞层的折叠多少，限制了它们的平移值。直径约1.3毫米的小鼠主动脉是接近临床相关（冠状动脉）人动脉（3）的唯一血管。

尽管鼠主动脉疾病模型具有翻译潜力，但目前的模型有局限性。这些模型需要先进的显微外科技术和专门的设备，如血管成形术气球和支架。在这里，我们现在一种新颖的，可重复的技术，以同时诱导VSMC增殖并破坏内皮屏障功能。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

道德声明:动物处理方案由马里兰大学机构动物保护和使用委员会（IACUC）批准（协议号0416009），并按照AAALAC-International标准进行。

手术程序

1. 麻醉技术
   1. 在121°C蒸汽灭菌30分钟后，将所有用于生存手术的仪器灭菌。
   2. 通过经精密蒸发器输送的100％O ₂和2.5％异氟烷的感应箱诱导麻醉。后感应，中止异氟烷并用O ₂冲洗室。 通过面罩和吸入1 L / min O ₂维持1.5-2％异氟烷麻醉。
   3. 将诱导室和面罩连接到用于废气吸附的炭清除剂中，以保护人员。通过证明确保充足的麻醉机表示没有对有毒刺激（脚趾捏）的反应。
   4. 创建由具有等温垫的手术托盘组成的手术区域，以在手术期间提供热支撑。额外的等温垫将为其恢复笼中的动物提供热支持。
2. 动物准备
   1. 对10-12周龄的雄性C57BL / 6小鼠进行以下调查。
   2. 用脱毛剂或具有40号刀片的电动剪刀从头骨上取下动物腹侧腹部的头发至腹股沟区域。
      1. 在脱毛剂的情况下，将该化合物施用于手术区2-3分钟，然后用棉花去除。我们使用市售的氢氧化钙和氢氧化钠的化合物。
   3. 用70％酒精制备肩膀上的区域，并用25号或更小的针孔皮下注射卡洛芬（5 mg / kg）。这个治疗将为动物提供术后止痛。
   4. 将动物转移到外科手术区域，并且位于背侧卧位。
   5. 用干净的棉花涂布器或棉纱布擦洗8-12％的碘 - 碘来准备手术部位。然后用70％酒精冲洗皮肤两次。
   6. 在双眼中放置眼部润滑剂以减少角膜干燥的发生率。用无菌悬垂覆盖手术部位。
3. 操作技术
   1. 做一个中间腹部剖腹手术切口大约2-2.5厘米长度与手术刀开始立即尾端剑突过程并延伸到骨盆。
   2. 调动小肠和十二指肠，并向右侧向反射。卷起一条无菌棉布，并用无菌盐水进行注射，以便包装内脏以改善暴露。
   3. 随着小肠动员到右侧腹部暴露后腹膜并将腹主动脉从左肾静脉暴露于主动脉分叉（ 图1 ）。
   4. 使用无菌棉花涂抹器，每次持续5秒，连续进行粉碎30次。
   5. 取出包装，并允许内脏返回原来的位置。
   6. 使用运行中的4-0可吸收单丝缝合（聚二恶烷酮）封闭筋膜。用运行中的6-0不可吸收的单丝缝合线（尼龙）封闭皮肤。
4. 恢复和后期护理
   1. 在手术之后，将动物置于具有干净的床垫的恢复笼中，以等温垫以继续热支持，直到动物能够正常行走。不要让动物无人看管，直到它显示出维持胸骨躺卧的能力。
   2. 术后第4 h每小时监测动物。一旦动物正在行走正常返回我到指定的畜牧室。在完全恢复之前，动物不会被安置在另一只动物的公司内。
   3. 在手术后的第一个72小时内每天监测动物两次，每周至少3次。监测包括每周三次称重动物。
   4. 皮下注射卡波芬（5 mg / kg），术后第一个72 h，每日两次。

2.采购组织

1. 安乐死方法
   1. 在预定的时间点安乐死动物。
   2. 通过经精密蒸发器输送的100％O ₂和2.5％异氟烷的感应箱诱导麻醉。
      1. 研究内皮细胞的完整性，将伊文思蓝染料给予动物。
         注意:Evans Blue是一种带负电荷的偶氮染料，对白蛋白具有很高的结合亲和力，只能在没有完整内皮的情况下染色血管s ="xref"> 6。
      2. 对于内皮完整性研究，在安乐死时，用5 mL 0.3％伊文思蓝染料，然后用生理压力5 mL PBS灌注动物5 min。在灌注过程中，将动物维持在麻醉手术平面中。
   3. 达到深度麻醉平面后，用胸骨切开术打开胸部。在右心房撕裂以允许从动物排出血液，并用21G针头进入左心室，并注射磷酸盐缓冲盐水（PBS），直到来自右心房的流出物清除。
   4. 用PBS灌注后，通过中线切口进入腹部。
   5. 再次，将小肠移动到暴露肾下主动脉的腹部右侧，从相邻组织中急剧解剖主动脉，并将其从左肾静脉切除至主动脉分叉。
   6. 将切除的主动脉存放在4％的多形态中直到组织处理发生。
      1. 对于内皮完整性研究，纵向打开主动脉并将其固定到暴露整个管腔表面⁶的蜡片上。用Evans Blue染料⁶进行染色程度，对内皮完整性进行定性评估。
      2. 对于其他组织学检查，横断面主动脉，并将其嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，如所使用的组织学方法所决定。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

切片嵌入OCT的横断面主动脉切片，用苏木精和伊红染色，然后用Verhoeff-Van Gieson（VVG）染色法染色，鉴定内外弹性片⁷ 。与用假手术治疗的动物的主动脉相比，剖腹术和单独的小肠动员相比，粉碎性损伤导致主动脉壁增厚。损伤后3天（42.2±1.7μm，单独用于剖腹手术时为22.1±1.1μm），外膜厚度与外膜距离为止（ 图2A-B ）。损伤导致细胞具有更圆?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

我们已经描述了导致内侧增生和内皮屏障功能障碍的鼠主动脉损伤模型的影响。沿主动脉内膜的部分EC分离伴随细胞细胞接触的丧失和细胞突起的增强。相应地，内皮屏障功能受到显着损害，刺激了丝裂原敏感信号传导途径，导致VSMC的增殖和血管壁的增厚。这种模式的优点是在技术上比其他主动脉疾病模型更容易学习和执行，并允许同时评估对损伤和内皮功能的增殖反应。该协议的关键步骤是实?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis