3D磁干细胞聚集和生物反应器为成熟软骨再生

摘要

从干细胞软骨需要微调的培养条件。在这里，我们提出了冷凝细胞磁性的方法，一个必不可少的步骤启动软骨。此外，我们显示，在生物反应器中动态成熟施加机械刺激，以在蜂窝结构和增强软骨细胞外基质的产生。

摘要

软骨工程仍因创建类似于天然组织的体外功能植入物的困难挑战。最近探讨自体替代发展的方法涉及干细胞分化为软骨细胞。要启动这个软骨，一定程度的干细胞需要的压实;因此，我们证实磁冷凝细胞的可行性，既厚支架和自由脚手架内，使用小型化的磁场源如细胞吸引子。这种磁性方法也被用来引导聚集融合，打造脚手架免费的，有组织的，三维（3D）的大小组织中几毫米。除了具有增强的大小，通过磁性驱动的融合形成的组织示于胶原II的表达的增加显著，观察聚集蛋白聚糖表达有类似的趋势。作为天然软骨进行力吨帽子影响了它的三维结构，还进行动态成熟。提供机械刺激的生物反应器被用来培养磁接种的支架在21天的期间。生物反应器的成熟大大改善软骨进入细胞化的支架;这些条件下得到的细胞外基质是富含胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖。这项工作概述在生物反应器用于改善软骨细胞分化，这两种支架和无内多糖支架标记的干细胞的磁性缩合和动态成熟的创新潜力。

引言

磁性纳米粒子在临床上用于磁共振成像（MRI）造影剂已经使用，其治疗应用不断扩大。例如，最近已经显示，标记的细胞可在体内使用的外部磁场在限定的注入^1，2，3的部位和操作可被引导和/或保持。在再生医学中，它们可以被用于工程体外 ⁴有组织的组织，包括血管组织^{5，6，7，8}的骨和软骨^9。

关节软骨浸渍在无血管的环境中，会发生损坏时使细胞外基质组分的维修非常有限。出于这个原因，researc目前h的重点，可以在缺损部位植入透明软骨替换的工程。为了生产自体替换，一些研究小组正在探索使用自体软骨细胞作为细胞源^10，11的，而另一些强调间充质干细胞（MSC）分化成软骨细胞^12，13的能力。在这里重现以前的研究中，我们选择MSC，因为他们的骨髓采样是相当简单，并不需要健康的软骨细胞，它可能失去其表型¹⁴的牺牲。

早期的步骤启动干细胞的软骨细胞分化的实质是他们的凝结。细胞聚集体使用的是离心或微团培养¹⁵共同形成;然而，这些冷凝方法neitheR有创建厚支架也不以控制聚集体的融合潜能内细胞团的潜力。在本文中，我们描述了一个创新的方法，利用冷凝MSC磁性标记和磁引力干细胞。该技术已被证明是形成通过聚集体的融合彼此自由支架-3D构建体，以获得毫米级软骨组织^9。厚和大的脚手架磁种也让增加工程化组织的大小，用于植入更容易设计的形状是有用的，多样化用于软骨修复的临床应用的潜力的可能性。在这里，我们详细地对MSC的磁播种到天然多糖，支链淀粉，和葡聚糖组成的多孔支架的协议，先前使用的支架，以限制干细胞^16,17。软骨分化finallÝ在生物反应器进行，以确保连续的营养物和气体扩散与细胞的高密度接种的支架的基质芯。除了提供营养物，软骨的生长因子，以及气体到细胞中，所述生物反应器提供机械刺激。总体而言，用于限制干细胞的磁性的技术，以在生物反应器的动态熟化组合，可以显着地改善软骨形成分化。

研究方案

1.磁性设备的建设

注意:用于细胞接种的装置取决于应用（ 图1）。形成聚集体，细胞的数量被限制在2.5×10 ⁵ /聚集体，所以磁性尖端必须非常薄（750微米直径）。种子的1.8厘米^七分之二毫米厚的支架，磁体必须更大（直径3mm），并确保通过支架的孔中的细胞迁移。

1. 与微磁体为聚集体形成的装置的结构（ 图1A）
   1. 使通过铝板0.8毫米钻微孔（直径3厘米和6毫米厚）。
   2. 插入一个磁性尖端（750微米直径）插入所述板的每个孔中。
   3. 将这个盘在永久钕磁铁，保证磁化饱和。
2. 设备的施工脚手架播种（ 图1B）
   1. 切割硬聚苯乙烯成2.4厘米^2米的正方形。
   2. 在相等的距离超过1.6 cm ²的表面积插入9个小磁铁（直径3mm，长6毫米_）。
   3. 将这个装置在永久钕磁铁。

2.干细胞标记

注:干细胞用0.1mM的磁性纳米粒子进行标记30分钟（2.6±0.2皮克铁/细胞）以形成聚集体，当他们用0.2mM的磁性纳米颗粒标记30分钟（5±0.4皮克铁/细胞）接种支架。这些纳米颗粒的浓度和温育时间先前已经使用并发表了MSC和其它细胞^{18， 图19，}和它已经确定的是纳米颗粒既不影响细胞生存力，也不MSC分化能力。由干细胞掺入的铁物料经由单CE测定LL磁^19，20。

1. 培养人间充质干细胞（MSC）在完整的间充质干细胞生长培养基（MSCGM），在37℃和5％CO _2，直至接近至汇合（〜90％）。
2. 无谷氨酰胺在的Roswell Park Memorial研究所（RMPI）改性的无血清的McCoy's5A培养基和含有5:;由0.1或0.2mM的磁赤铁矿柠檬酸被覆铁氧化物（8nm的直径的芯_γFe2 O _3）混合制备磁性标记溶液mM柠檬酸钠。
3. 弃去培养基，用清洗无血清的RPMI培养基中的细胞没有谷氨酰胺，并添加10毫升每150-cm ²的培养瓶中，以覆盖所有细胞所需的最小体积的氧化铁纳米颗粒溶液。
4. 孵育在37℃下30分钟和5％CO _2，然后丢弃该纳米颗粒溶液。冲洗5分钟用无血清的RPMI培养基中，而不谷氨酰胺内化楠oparticles仍然附着至质膜。
5. 丢弃该RPMI培养基并添加25毫升每烧瓶完整MSCGM培养基。在37℃下孵育过夜，5％的CO _2。

3.磁性细胞种植

1. 新鲜加入50μML-抗坏血酸-2-磷酸，0.1μM地塞米松，1mM丙酮酸钠，0.35毫摩尔L-脯氨酸，1％万向培养制备使用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖L-谷氨酰胺的软骨形成培养基补充含有胰岛素，人转铁蛋白和硒酸（ITS-预混料），和10ng / mL的转化生长因子-β3（TGF-β3）。
2. 分离使用每150-cm ²的培养瓶中0.05％胰蛋白酶-EDTA和离心机的8毫升的解离的细胞的磁性细胞在260×g下5分钟。吸出介质并计数的重新悬浮的细胞。
3. 放置在两磁性设备的顶部玻璃底细胞培养的培养皿（35毫米）。
4. 到magnetically形成聚集体，加入3毫升软骨形成培养基到培养皿中，并轻轻地沉积含2.5×10 ⁵个标记的细胞每个聚集体（最多16个聚集体可以被沉积）的最小体积可能的（不超过8微升）。离开培养皿20-30分钟而不移动它，允许它以形成球状体，然后将完整的设备，包括含有16个聚集体的培养皿，放入培养箱中在37℃和5％CO _2。
5. 以下形式控制聚集体相同的协议和与没有TGF-β3软骨形成培养基替换完全培养基。
   1. 为了产生3D聚集体构建体，放置2点聚集在第8天接触，以形成8个双峰并启动所述融合。第11天，合并2个双峰形成4四胞胎。最后，融合在第15天的4四胞胎，得到最终的结构。
   2. 与此同时，通过离心分离2.5×10 ⁵形成聚集体标记的干细胞在26015; （分别为样品和对照）克在15-mL管5分钟用1.5mL有或没有TGF-β3软骨形成培养基的。
6. 以磁性种子支架，将每个干燥支架到培养皿。使用由支链淀粉/葡聚糖²¹的多糖多孔支架。对于每一个支架，在稀软骨形成培养基的350微升2×10 ⁶标记的干细胞而不TGF-β3和小心移液管将细胞在支架上。
   1. 孵育5分钟，在37℃，以允许在支架内充满细胞穿透，然后轻轻地用或不用TGF-β3（分别用于样品或对照）的培养皿中添加软骨形成培养基的3毫升。
   2. 孵育其磁性装置上的细胞化的支架在37℃和5％CO ₂ 4天，以允许通过所述支架的孔和禁闭细胞迁移。
7. 与此同时，种子支架与2×10 ⁶ 以下标记的干细胞相同的方法和未经孵育所述磁体，以获得均匀接种的支架作为阳性对照。

4.分化为软骨细胞

注:温育后的第4天，除去磁体并继续成熟软骨或者在皮氏培养皿（静态条件）或在生物反应器（动态条件）。阴性对照样品的成熟与无TGF-β3软骨中静态条件。

1. 在静态条件下，保持在同一个培养皿中的细胞化的支架或聚集体。一个星期更改软骨中两次21天。
2. 在动态条件下，制备的生物反应器。
   1. 根据制造商的方案在适当的长度切断硅树脂管。
   2. 高压灭菌的所有材料:500mL的培养室，管道，2路旋转器，和笼子。
   3. 生物反应器部件放入无菌就微生物逻辑安全站。管道连接到2路旋转器和培养室按照制造商的说明。
   4. 小心地将细胞化的支架转移到使用无菌刮刀消毒的笼子。将每笼2个支架。当笼子里准备好了，将它们插入到盖的针，让他们进一步旋转过程中移动。填充软骨形成培养基的培养室，用含有笼中的盖子关闭。
3. 打开蠕动泵，以填补软骨中的管道和消除气泡。
4. 放置和填充室固定到所述生物反应器的马达和打开计算机，其控制所述臂的与所述腔室的旋转上。
5. 在臂和腔室都应用每分钟5转数（RPM）的转速。调整以10rpm的流速为细胞化支架的连续进给的蠕动泵。

5。 RNA提取和基因表达分析

注意:在此之前RNA提取，消化支架与酶溶液。

1. 通过添加100μL的支链淀粉酶（40U / mL）和葡聚糖酶的50微升（60毫克/毫升），以850毫升的无血清DMEM培养基中制备1毫升的酶溶液。
2. 用无血清的DMEM培养基冲洗两次支架，弃去培养基，并加入每支架的酶溶液的800μL。孵育在37℃下轻柔搅拌15-30分钟。
3. 当支架被完全溶解，转移在300×g下将含有细胞的1.5毫升管中的溶液，离心10分钟，小心地吸出培养基，用无菌1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），离心机在冲洗两次300×g的10分钟，并重新悬浮在RNA分离溶液中的细胞。
4. 取出从聚集体RNA，将球状体中的RNA分离溶液和执行RNA提取之前用均化器粉碎完全它们。
5. 隔离根据制造商的说明使用试剂盒提取总RNA的RNA。
6. 根据制造商的说明从使用逆转录酶400纳克的总RNA合成互补DNA，使用250纳克随机引物，1微升dNTP混合物（每种10mM），和40U / ml RNA酶抑制剂;反应的最终体积为20μL。在反应结束时，加入80μL的蒸馏水中，得到100微升的最终体积。
7. 对于定量聚合酶链式反应（PCR），使用含有荧光试剂的PCR混合物中定量的感兴趣的基因，如聚集蛋白聚糖（AGC）和胶原II（山口II）的相对表达，用10×稀释的cDNA。标准化基因的表达水平与参考基因核糖体蛋白，大的，P0（RPLP0）。 ^ΔΔCT式^-与2执行计算其中ΔΔCT=ΔCT的分化的条件 - 平均ΔCT的控制条件，并且每个ΔCT代表感兴趣的基因的CT - 参照基因（RPLP0）的CT。
8. 确定为平均值±平均值（SEM）的标准误差的统计测量。执行用正≥2个独立实验的分析。使用学生t检验来分析离心颗粒和磁性融合体（* P <0.05）之间的统计学差异。确定与Kruskal-Wallis检验（单向ANOVA非参数）的意义进行分析有区别的支架控制支架之间并具有统计学差异（* P <0.05）。

6.组织学分析

1. 冲洗细胞化的支架或聚集体，用无菌1×PBS，修复它们在10％福尔马林溶液，在室温下1个小时，并用1×PBS冲洗。
2. 除去PBS，在最佳cuttin嵌入样品克温度化合物（OCT），并且在异戊烷浴浸入液氮中冷冻。存储在-20℃下的样品。用低温恒温器以获得所述聚集体或12微米的细胞化的支架8微米冷冻切片切割样品。
3. 染色用0.5％甲苯胺蓝溶液的冰冻切片2分钟，漂洗在自来水中，用100％乙醇脱水，澄清使用甲苯，并与用于光学显微镜的安装介质装入滑动。

结果

首先，聚集体可以单独使用微磁体通过沉积2.5×10 ⁵个标记的干细胞（ 图2A）形成的。这些单个聚集体（〜大小0.8毫米）然后可融合成由于连续的，磁感应融合较大的结构。例如，在成熟软骨的第8天，聚集体放置在对以形成双联体接触;四胞胎通过合并2个双重峰组装在第11天;最后，在第15天，将4四胞胎融合以形成包含最初形成的聚集体16的3D构建体，总4?...

讨论

首先，因为这里提出的技术依靠磁性纳米粒子的内化，一个重要的问题是纳米粒子的结果，一旦他们定位在细胞内。这是事实，铁纳米颗粒可以触发潜在毒性或取决于它们的大小，涂层，和曝光^19，22的时间受损分化能力。然而，一些研究已经显示在细胞生理学没有影响当包封的铁纳米颗粒在magnetoferritin的形式，生物磁性纳米粒子²⁴使?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'