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摘要

该协议描述了果蝇中可扩展的个体梳理分析技术，产生强大的定量数据来测量梳理行为。该方法是基于在一段时间内比较未修饰动物与修饰动物的身体上染料积累的差异。

摘要

果蝇的美容行为是一个复杂的多步运动计划，需要协调的前肢和后肢的运动。在这里，我们提出了一个整理测定方案和新颖的室设计，可以成本效益可扩展，可以进行小型或大规模的果蝇梳理研究。苍蝇在整个身体上撒上了黄色染料，并给予时间从室内的身体上除去染料。然后将苍蝇沉积在一定体积的乙醇中以溶解染料。测量和记录用于修饰的和未移植的动物的染料 - 乙醇样品的相对光谱吸光度。该方案产生个体苍蝇染料积累的定量数据，可以容易地平均和比较样品。这允许实验设计容易地评估突变动物研究或电路操作的修饰能力。这个有效的过程既是通用又可扩展的。我们显示wWT动物和突变体动物之间的协议和比较数据为果蝇 I型多巴胺受体（DopR）的扫流。

引言

果蝇黑腹果蝇 （ D. melanogaster ）是一种强大的天生行为，涉及到多个独立运动程序的协调1 。果蝇清除身体的灰尘，微生物和其他可能抑制正常生理功能如视力和飞行的病原体，或导致显着的免疫挑战。在感测和响应机械2和免疫激活3时 ，苍蝇重复地将腿部在一起或在目标身体区域上摩擦，直到其足够清洁并且梳理进行到身体的另一部分。苍蝇执行在不同的较量疏导运动在很大程度上发生在刻板图案1,4。优先考虑信号，行为层次变得明显。电路和活动模式已被确定为支持ofa模型，首先发现层次顶部的修饰程序，并抑制随后修饰的身体区域的平行信号5 。最重要的是给头，然后是腹部，翅膀，最后是胸部5 。

黑腹果蝇的修饰程序是研究神经回路，调节分子信号和神经递质的理想系统。例如，神经纤维瘤功能6的损害， 果蝇脆弱的X型精神发育迟滞蛋白（ dfmr1 ） 7的损失和双酚A（BPA） 8的暴露都会导致过度的梳理和类似于神经纤维瘤病的离散人类症状的脆弱X综合征和自闭症谱系障碍和注意缺陷多动障碍（ADHD）的方面。修饰行为也可以是习惯在突变菌株2上差异化，将该运动程序提供给行为可塑性的研究。可以用果蝇建模的神经学现象的广度需要一种新颖的比较方法来测量苍蝇自身修养的能力。

囊泡单胺转运体和多巴胺和身体中的其它生物胺的相对丰度的联合作用已被证明介导果蝇梳理行为9,10。八聚胺和多巴胺刺激斩首苍蝇中可比的后腿修饰活性，而八胺的前驱酪胺也触发了较少的梳理7 。四多巴胺受体已经在果蝇 11，12，13，14被确定。通过使用本方案中描述的修饰测定方法，我们确定了I型家族多巴胺受体DopR（ DopR，dDA1，dumb ）在后腿修饰行为中的作用15 。

疏导可以通过查看清洁度通过该动物可以用标记染料或荧光灰尘5,16喷粉整个身体后充分培训的程度来间接定量。残留在身体上的剩余灰尘可以用作总体行为的相对标记。经过足够的时间培养后，尘土飞逝，可能会在修饰行为中表现出特定的赤字。随着梳理调查变得更加广泛，方案已经将诸如斩首加入颈部连接神经10的措施 ，刷毛的触觉刺激以引起修复反应2 ，和录像的行为15 。修饰的直接观察可以通过使用视觉观察和手动记录特定事件疏导4的频率和持续时间来容易地研究。

我们设计了一个十五分钟的梳妆室，可以用3D打印机或激光切割机构造，蓝图设计可用于复制15 。该设计使用两个连接的中心板，其具有通过网格分开的开口和分开的两个另外的滑动顶部和底部平板，从中分别装载飞行物和/或染料。经过粉尘飞行时间后，我们将其沉积在乙醇中以溶解染料，并测量该溶液在染料波长处的吸光度。平板读数器可用于多个平行样品，或者单次读取分光光度计可用于单个样品。这种方法最大限度地减少了由处理引起的误差低成本测试法以更小，更具成本效益的规模运行。这种方法是由Julie Simpson和Andrew Seeds率先推出的方法衍生和修改的，他们使用带加热元件的较大梳妆室进行温度敏感电路操作5 。以下方案展示了全身梳理的量化，并显示了用于定量各个身体部位的染料积累的替代方法。我们还提供了WT和DopR突变体之间的样本比较数据，以及用于计算修饰行为的简单性能指标的方法。

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研究方案

准备

  1. 准备一个将活的果蝇从培养瓶移动到梳妆室的吸气器。吸气器允许有意识的动物转移到行为室，以确保麻醉不会影响随后的行为观察。
    1. 使用剪刀切割1.5英尺的管道ID"⅛"，OD¼"。至少1英寸的1毫升一次性微量吸头尖端。在切割尖端上握住1厘米长的网格（开口0.196英寸）。
      注意:大多数1毫升尖端具有渐变线，其中尖端位于包装盒中，通常切割到该线。
    2. 将新鲜的1毫升微量吸头贴在网眼/切口上。观察网格形成两个尖端之间的紧密屏障。新尖端的内部为苍蝇创建了一个保持室。
    3. 切开新的微量移液器吸头的末端以扩大开口，以允许单个飞行通过。霍尔e将大致匹配梳妆室的开口（直径约1.5-2毫米）。
    4. 将嵌套的尖端贴合在管道的末端。将尖端推入管中以确保紧密配合，以允许真空压力。
    5. 在管的另一端，切下200μL微量吸头的尖端，并将狭窄的切割端装入管道。这是吸气器的"嘴"一侧。
  2. 准备粉尘等分试管。称量大约5毫克的亮黄色染料在称重纸上。将灰尘倒入0.6 mL微量离心管中，并紧紧盖住盖子。
    注意:我们建议在等分试样中使用丁腈手套，因为一些乳胶手套对染料是可渗透的。
  3. 对实验中的所有样品重复步骤1.2）（每个室中每次飞行一次）。
  4. 准备乙醇（EtOH）管:将1 mL 100％乙醇吸入1.5 mL微量离心管中。用于基因型或条件的标记管/ LI>
  5. 对实验中的所有样品重复步骤1.4）（每个室中每次飞行一次）。盖上并保存EtOH管以完成修饰测定。还包括至少一个"空白"样品，其仅为1mL EtOH而不用于阴性对照。
  6. 通过拧紧滑动顶板（具有较小的孔），但留下底板（带有较大的孔）以除去灰尘，组装每个梳妆室。
  7. 将每个必要的梳妆台平放在桌子上，顶面朝下。飞进入面是面朝下的。
  8. 将5毫克亮黄色染料分批装入每个室中，方法是将管子靠在所需孔上方的表面上。将舱室靠在桌子上，以确保所有的灰尘都通过网格落到顶板上。
  9. 将底板拧到每个室上，使得圆锥形开口的较宽端面朝外，孔不会靠在井上。保护机器人使其不会滑动并释放染料。
  10. 将房间翻转并将其平放在桌子上几次，以便灰尘通过网状物落在底板上。
  11. 将舱室的顶板滑入"打开位置"，使小孔与十五口井对齐，从而将苍蝇引入各个井。

飞尘和美化

  1. 通过轻轻地吸入吸气器的一端，如同使用吸管一样，将一个飞入吸入器。通过轻轻吹起并将开口朝向目标来存放苍蝇。
  2. 将一只蝇吸入用于实验的每个孔中。装载井后，滑动顶板，以便在整个舱室装载期间将飞行物捕获在舱室中，并将胶带放置在该井口的开口处，以防止在装载其他井时飞行逃生。如果多个苍蝇被吸入一个单一的好吧，离开这个开放，直到只剩下一只苍蝇。
  3. 在所有必需的井充满苍蝇之后，翻转室，使得底板向上，使得灰尘有可能通过穿过网状物覆盖苍蝇。
  4. 通过拧紧螺丝紧紧固定顶板和底板，并旋转室以将苍蝇粉碎4秒。
  5. 将房间（顶板朝下）撞在桌子上两次，使染料落到另一边。然后，将腔室翻转（顶板朝上）并敲击腔室两次，以确保染料沉淀在底部腔室的地板上，远离保持在顶部腔室中的苍蝇。
  6. 对于不允许修改的控制蝇，请立即进入协议的步骤3。对于将完成测定的苍蝇，请转到步骤2.7。
  7. 将房间平放在桌子或台面上，顶板向上放置三十分钟，以便苍蝇修剪。放下小屋呃在噪音和无振动的空间，以保持你的环境恒定，所有的修饰实验（照明水平，湿度和温度）。 RT或25°C带有湿度控制器的桌面孵化器是理想的选择。

3.样品制备和吸光度分析

  1. 将顶板向上保持，轻轻拧下底板，将其从室中取出，注意不要弄脏染料。
  2. 将房间放置在飞行CO 2垫上，气流低，直到苍蝇麻醉。
  3. 从室中拧下顶板。仔细使用镊子抓住一条腿，并从每个室移动一个除尘飞沫，并将其沉积在含有EtOH的1.5 mL微量离心管中。每个包含一个飞行的15个腔室的传送时间约为3-5分钟。如果/当使用多个室进行惊人的实验时，实验者应该考虑转移时间，以确保实验的有效分期。
  4. 一旦每个微量离心管包含1个飞，关闭盖子并将管反转三次以搅拌并混合染料和乙醇溶液。
  5. 孵育含有乙醇的管并在室温下飞行5小时，以确保将染料从飞入物中完全除去。 5小时后，短暂地旋转每个管（2秒），以确保染料从苍蝇中清除。
  6. 将等分试样将50μL实验的1.5mL试管插入96孔板的孔中（如果有的话），注意每个样品在板上的位置。加入200μLEtOH稀释样品5x。稀释避免了重灰尘飞扬或大修饰缺陷的天花板效应。
  7. 使用平板读数器分析每个样品在397 nm。或者，如果读板器不可用，则在标准分光光度计上测量可见光谱中各个样品和毛坯的吸光度。
  8. 通过读卡器阅读并记录样品，并将该电子表格与记录仪一起保存d样品在板上。

4.结果量化

  1. 编译所有样本的结果，并测量每个基因型或病症的方差。
    注意:使用通过单因素方差分析和Bonferroni校正或多次平行比较的其他校正的统计分析将时间0分钟和时间30分钟的染料积累视为单独的条件。
  2. 使用以下等式计算每个基因型/条件的梳理百分比差异:[（时间0'处的染料积累平均值 - 时间30'处的染料累积平均值）/时间0处的染料累积平均值×100。
  3. 在条形图中表达每种基因型和条件的百分比，并比较基因型和条件。

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结果

修整测定产生定量数据，以在设定的测量时间（30分钟）后，基于剩余在苍蝇体上的累积染料的相对剩余量来评估行为性能。 图1中突出显示了滑动梳理室设计的示例图像和测定的主要步骤。苍蝇通过在染料存在下涡旋聚集大量的染料从立即粉尘（ 图2d，2e ）。除尘蝇可以在分析后保留一定范围的染料积累（ 图2f，2g ）。因此，溶解在...

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讨论

梳理分析相对简单，但我们会提醒实验者特别注意以下问题。在引入苍蝇和染料之后，通过拧紧顶板和底板上的螺丝来保持紧密的密封，对于可重现的结果至关重要。亮黄色染料非常细，松散的接头将会损失室内边缘的染料。每个井的染料含量的不规则性可能容易导致梳理量化，因为不均匀的粉尘会增加梳理事件的差异和假阳性率。此外，我们鼓励实验者在30分钟的梳理期间，意识到他们选择保?...

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披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们要感谢Brian Shepherd，Tat Udomritthiruj，Aaron Willey，Ruby Froom，Elise Pitmon和Rose Hedreen，以便早日测试和建立这种方法和室设计。感谢Kelly Tellez和Graham Buchan的阅读和编辑手稿。我们感谢Andrew Seeds和Julie Simpson的开创性工作，并就建议使用亮黄色染料（Sigma）提供建议和支持。这项工作由Mary E. Groff外科和医学研究与教育慈善信托基金，Bronfman科学中心和Hellman研究员计划部分支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
High-Flex Tygon PVC Clear TubingMcMaster-Carr5229K54ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators
Micropipette tips (1 mL and 200 μL)Genesee Scientific24-165, 24-150R
Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6"McMaster-Carr9318T44Used to construct grooming chamber and mouth aspirators
Dumont #5 ForcepsRoboz Surgical InstrumentRS-5050
Brilliant Yellow DyeSigma-Aldrich201375-25Gwe recommend use of nitrile gloves while handling this product
VortexerFisher Scientific12-812set to "touch"
EthanolCarolina Biological Supply86-1282
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR International10025-726
0.65 mL microcentrifuge tubesVWR International20170-293tubes can be reused with successive assays
UV 96-well plateCorning26014017
BioTek Synergy HTX PlatereaderBioTekneed to download catalog to access product numberhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBioTek
Microsoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Drosophila IncubatorTritechDT2-CIRC-TK
1/4" acrylic plasticMcMaster-Carr8473K341
8 - 32 nutsMcMaster-Carr90257A009
8 - 32 x 1" hex cap screwsMcMaster-Carr92185A199the bottom plate needs to be tapped for this size screw
8 - 32 x 1/2" hex cap screwsMcMaster-Carr92185A194the second plate from the top needs to be tapped
2 - 56 3/8" flat head phillips machine screwsMcMaster-Carr91500A088these hold the two middle plates together
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipeMcMaster-Carr92510A044Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.  These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate

参考文献

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