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摘要

器官海马切片培养 (OHSC) 代表一个体外模型, 它能很好地模拟体内的情况。在这里, 我们描述一个 vibratome-based 改进的切片协议, 以获得高质量的切片, 用于评估新物质的神经保护潜能或肿瘤细胞的生物学行为。

摘要

在器官海马切片培养 (OHSC) 中, 神经元和胶质细胞的形态和功能特征得到了很好的保存。该模型适用于处理不同的研究问题, 涉及神经保护、神经元电生理实验、神经元网络或肿瘤侵袭等研究。multisynaptic 回路中的海马结构和神经元活动在 OHSC 中很好保存, 尽管切片程序本身最初会损伤并导致胶质瘢痕的形成。瘢痕的形成可能改变了小分子的力学性质和扩散行为,等。切片允许在没有动物手术的情况下监测脑损伤后的时间依赖性过程, 并研究各种脑源性细胞类型的相互作用, 即在生理和病理上条件.这个模型的一个矛盾的方面是缺乏血流和免疫血细胞。在神经元损伤过程中, 从血液中迁移免疫细胞起着重要作用。当这些细胞在切片中丢失时, 就可以观察到文化中的内在过程, 而不受外界干扰。此外, 在 OHSC 中, 中外部环境的组成是精确控制的。这个方法的一个进一步好处是被牺牲的动物的数量比标准准备更低。几个 OHSC 可以获得从一个动物做同时研究与多个治疗在一个动物可能。由于这些原因, OHSC 很适合分析新的保护疗法在组织损伤或肿瘤侵袭过程中的作用。

这里介绍的协议描述了一种 OHSC 的制备方法, 它允许产生高重复性的、保存完好的切片, 可用于各种实验研究, 如神经保护或肿瘤侵袭研究。

引言

OHSC 是一个良好的体外模型, 研究神经元、星形胶质细胞和小鼠的生理和病理性质,1。对细胞外环境进行控制, 对各种刺激后的细胞学和形态学变化进行监测是很容易的。在准备2,3之后, 海马神经元的组织及其连接保存完好。在一些优势, OHSC 允许监测脑损伤和肿瘤侵袭没有动物手术。六至八 OHSC 可从单个啮齿动物的大脑中获得。因此, OHSC 有助于显著减少动物数量, 并允许在同一动物体内检测多种药物浓度、基因操纵或不同的损伤模型。在 slice-based 测定中, 可以精确控制实验条件。此外, 时间依赖性发展的病理条件, 如次生损害, 可以很容易地监测的延时成像。

在给定的协议中, 最初由 Stoppini et al.建立4, 描述了准备步骤, 并突出显示了选择适当切片的重要形态学标志。我们建议在后天准备7-9 大鼠或产后日4-5 只小鼠。在这些时期, OHSC 表现出对机械创伤的强大抵抗力和神经元回路重组的高电位。相比之下, 从胚胎或成年大鼠的准备工作迅速改变其结构, 并失去其器官形态学在种植期间, 因此更不适合研究长期的过程中的基础研究5,6,7,8,9,10,11. OHSC 生存率的另一个关键点是切片本身的厚度, 作为扩散, 因而养分供应是有限的12,13,14。

研究方案

动物实验是按照欧洲共同体理事会 2010/63/欧共体欧洲议会指令批准的《关于在神经科学研究中使用动物的政策和政策》进行的。欧洲联盟理事会关于保护用于科学目的的动物的问题.

1. 准备仪器和培养基

  1. 准备 OHSC 使用以下工具集: 两个小剪刀, 两个弯曲的镊子, 一个镊子与罚款提示, 三刀片 (两个大小 11, 一个大小 15),三手术刀夹, 圆形滤纸 (直径:35 毫米), 琼脂, 一刀片, 一个未修改的巴斯德吸管, 和一个没有小费的改良巴斯德吸管。使用前灭菌釜中的所有物料 ( 图 1 ).
  2. 称5克琼脂, 在100毫升蒸馏水中溶解。在20分钟的121.7 和 #176 消毒解决方案; C 在210.8 人民军在一个高压釜。使用无菌玻璃吸管将3毫升液体琼脂溶液分布在 60 mm 的培养皿中, 使其固化5小时, 用塑料石蜡膜覆盖, 以避免污染并贮存在4和 #176; C 直到进一步使用。在切片过程中, 需要用琼脂块来稳定大脑.
  3. 媒体
    1. 使200毫升的制备介质 (pH 7.35) 由198毫升极小必需介质 (记忆) 和2毫升 l-谷氨酰胺溶液 (最终浓度 2 mM) 组成。在媒体准备的当天准备解决方案, 并将其存储在4和 #176; C.
    2. 准备100毫升的培养基由49毫升的记忆, 25 毫升汉克斯和 #39; 平衡盐溶液 (HBSS), 25 毫升 (v/v) 正常马血清 (NHS), 1 毫升 l-谷氨酰胺溶液 (最终浓度2毫米), 100 和 #181; g 胰岛素, 120 毫克葡萄糖, 10 毫克链霉素, 1万 U 青霉素, 800 和 #181; g 维生素 C 以前报告。加热介质 (37 和 #176; C), 将 ph 值调整为 ph 7.4 和无菌过滤器 (0.2 和 #181; m 孔径大小)。在更改介质之前, 重复该过程 (升温、pH 值调整、 等 ) 每第二天。存储在4和 #176 时最多使用一个星期的介质; C.
  4. 用准备介质填充一个 35 mm 的培养皿来存储大脑。放置两个空的培养皿, 用于在工作区的冷却包上收集组织.

2。准备和切片用 Vibratome

  1. 使用7-9 天大鼠或4-5 天老老鼠的大脑进行 OHSC 准备, 根据 Stoppini et al 。4 动物斩首后, 用剪刀从头骨上取下皮肤.
  2. 将一根细剪刀的刀片引入孔内, 并通过沿尾 (后) 侧 (前) 轴切割来打开颅骨。垂直于第一个切口, 使剪刀指向左右耳, 分别 (#34; T 形切口和 #34;).
  3. 小心地用细钳打开颅骨, 注意不要伤害大脑。使用手术刀 (刀片大小 11), 以削减最侧的部分额杆和小脑.
  4. 通过刮刀, 移除大脑并将其小心放置在填充有准备介质的培养皿中 ( 图 2 )。将大脑放置在标本架上, 用医用氰胶水固定。使用琼脂片确保机械稳定.
  5. 在350和 #181 中横向解剖组织, 使用滑动 vibratome OHSC.
  6. 使用双目显微镜对切片进行光学评估。立即丢弃低质量的 OHSC。这是很重要的, 只有那些完整的细胞从海马体的中间部分分离 (见图3和 4) 之间的背部和腹海马.
  7. 用手术刀分离海马区和嗅皮质 (圆刀片大小 15; 图 3 )。必须保留 perforant 通路和嗅皮质.
  8. 六到八 OHSC 从每个大脑中获得。将2-3 切片转换为一个单元格区域性插入 (孔径0.4 和 #181; m), 并将其放置在一个6井培养皿中, 每井含有1毫升培养基.
  9. 在35和 #176 中孵育6个以上的菜; C 在完全湿润的气氛中, 5% (v/v) CO 2 并每隔一天更改单元培养基.
    注意: 在6天的 体外 (div) 中进行实验。与切片程序相关的炎症反应在6天消失。在这个阶段, 胶质细胞再次显示出分支形态, 突触连接已经成熟.

3。组织质量的评价

  1. OHSC 中变性神经元的固定、标记和可视化
      在执行实验后, 用5和 #181 孵化 OHSC; 碘碘 (PI) 在固定前2小时, 在为了使退化神经元的细胞核染色.
      注意: PI 是一种疑似致癌物, 总是穿戴个人防护用品 (PPE) 如手套.
    1. 用0.1 米磷酸缓冲液 (pH 7.4) 清洗 OHSC, 并用 4% (v/v) 溶液将其固定在 24 h 的甲醛 (粉煤灰) 中.
      警告: 粉煤灰是一种有毒和可疑的致癌物质。工作在油烟罩和穿戴 PPE.
    2. 用1毫升 PBS 清洗 OHSC, 使用工刷将切片与膜分开.
    3. 用 IB 标记 OHSC 4 在24个井板上染色 ( 图 5 ).
  2. 在实验开始前使用荧光标记的单细胞进行肿瘤侵袭实验的传导, 使用荧光染料羧基双乙酸琥珀酰亚胺对肿瘤细胞进行标记酯 (CFDA SE).
  3. 使用 Neubauer 室分离和计数肿瘤细胞.
  4. 重中的单元格, 例如10和 #181; 悬浮液的 L 包含所需的单元格数 (通常为5万或10万单元格).
  5. 应用10和 #181; L 细胞悬浮在切片培养上, 允许细胞侵入3天.
  6. 在实验结束时, 使用 4% (v/v) 的煤灰为24小时修复切片区域性, 并将 co-cultures 与 PI 标记为另 24 h 以可视化细胞.
    警告: 粉煤灰是一种有毒和可疑的致癌物质。工作在油烟罩和穿戴 PPE.
  7. 将 co-cultures 安装到盖板上, 以便使用安装介质进行进一步分析.

4。OHSC 实验的评价

使用共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 对 OHSC 进行分析。用于检测 pi 标记, 变性神经元或 pi 标记细胞使用波长和 #955 的单色光; = 543 nm 和一个发射带通滤波器的波长和 #955; = 585-615 nm。对于 CFDA 标记的肿瘤细胞或 IB 4 小胶质瘤, 使用 #955 的激发波长; = 488 nm。对于这两种实验类型, 记录一个 z 堆栈与2和 #181; m 厚的光学切片, 并用于评估.

结果

神经保护研究:为了确定神经元损伤, 计数的 PI 阳性核和 IB4阳性小胶质细胞在每三个光学部分的颗粒胞层 (协鑫) 的齿状回 (DG) 的数量。对于肿瘤侵袭实验, 采用最大强度 z 投影法计算肿瘤细胞覆盖面积, 作为入侵的测量手段, 并对不同的入侵模式进行可视化 (图 6)。

在未经治疗的控制 O...

讨论

本议定书描述了 OHSC 的准备工作。这个模型允许测试的内在能力和脑组织的反应后, 应用的生理和病理刺激。除了对电生理参数的分析外, OHSC 可以损伤, 并可确定损伤对所有细胞类型的影响。治疗与不同的物质和详细描述毁损过程或愈合在没有巨噬细胞和淋巴细胞是可能的。

成功的准备和培养的最关键的步骤是: 1) 在无菌条件下工作, 2) 正确准备介质, 考虑温度和 pH 值, 和 3) ?...

披露声明

作者没有透露

致谢

作者想感谢克里斯汀· Auste 的支持, 她的视频录音和 Chalid Ghadban 为他的出色技术援助。Urszula Grabiec 是支持 FKZ 29/18。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
6-WellFalcon35-3046
AgarFluka5040
AutoclavSystecDX-45
CFDA Thermo FisherV12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium Invitrogen32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin IVector LabsFL-1101
GlucoseMerk1083371000
GlutaminInvitrogen25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)Invitrogen24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)Invitrogen14170-138
InsulinSigma AldrichI5500
L-ascorbic acidSigma AldrichA5960
L-GlutaminInvitrogen25030-024
LN229Cell-Lines-Service300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)B.Braun1050052
Millicell Culture InsertsMilliporePICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acidSigma AldrichM3262
Normal Horse SeumInvitrogen26050-088
Penicillin StreptomycinInvitrogen15140-122
Petri dishes (all sizes)Greiner627160/664160/628160
PFARoth0335.1toxic
Propidium iodid (PI)Sigma Aldrich81845-25MGtoxic
U138ATCCHTB-14
VibratomeLeicaLeica VT 1200

参考文献

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