JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

一旦从主体去除，神经元组织大大受环境条件的影响，从而导致组织的最终降解后6 - 8小时。采用了独特的培养方法，该方法密切监测和调节组织的胞外环境中，组织的生存力可以显著延长> 24小时。

摘要

急性神经组织准备，脑切片和视网膜wholemount，通常只能维持6 - 解剖之后8小时。这限制了实验时间，并且增加被每研究利用的动物数量。这种限制影响特别协议，如要求延长预孵育浴用的染料钙成像。 3内指数细菌的生长 - 切片后4小时，紧密与组织健康的减少有关。该研究描述了用于限制细菌的增殖急性制剂维持而不需要抗生素，无菌程序，或组织培养基含有生长因子的长时间（> 24小时）的活的神经元组织的方法。通过循环外液通过紫外线照射，并在15保持组织中一个自定义的保持室 - 16℃下，将组织表示在电生理特性，或钙SI没有差别通过细胞内钙染料在> 24小时postdissection gnaling。这些方法不仅会延长实验时间，使用急性神经元组织的那些，但会减少完成实验目标所需动物的数量，并且将设置为急性神经元组织培养的金标准。

引言

电生理和功能成像（钙，电压敏感性染料）是两个在神经科学中最常用的实验技术。脑切片制剂和视网膜wholemount，这将在这里检查，提供检查电生理特性和突触连接不脱离麻醉剂或肌肉松弛剂的污染的装置。脑切片和视网膜wholemount保持其结构的完整性，不同文化或细胞匀浆，允许特定电路和大脑网络1的研究。从孤立的组织录制有超过体内录音与心跳和呼吸相关的运动优势被淘汰。此外，直接可视化使细胞的特定的类来进行有针对性的，和药理学工具2，3本地应用程序。

膜片钳和钙鎓染料加载视网膜wholemount由内的界膜（ILM），它涵盖了视网膜神经节细胞（RGC）层，并防止对细胞的直接访问的存在复杂。通常情况下，该膜被刮掉用玻璃吸管，以允许在单个小区中的千兆欧姆密封件的膜片吸管和形成的直接应用。此外，浴施加钙染料不交叉在ILM和必须或者该膜4下方喷射，逆向转移注射后在视神经5或穿过组织6电穿孔。此外，利用视网膜色素变性的啮齿动物模型时，RD / RD鼠标，ILM是更厚，更令人费解。在这里，我们使用的技术与酶消化7删除ILM，同时允许普遍存在钙染料加载，并直接进入视网膜神经节细胞的膜片钳recordiNGS 8。

无论从大脑切片或视网膜wholemount成功的记录取决于解剖和可行的神经组织的培养。通常情况下，组织被提取的实验的早晨，直到它被用于记录在人工脑脊液（ACSF）温育。通常，组织保持生存能力6 - 8小时，用这个时间窗口以下显著降解。但是，这两个脑切片和wholemount视网膜制剂通常产生比可以从该短的时间内被记录更多的组织。因此，组织通常被丢弃在一天结束和解剖再次完成在随后的几天。这意味着其他动物被利用，并建立和解剖/染色反复〜2小时。以下方案描述了一种用于延长神经元组织的寿命为24小时以上，这意味着较少的动物被利用，以及更多的实验时间是可用的。组织活力W¯¯通过录音电生理特性和钙的动态评估，这些特性均<4小时和> 24小时postdissection之间没有什么区别。

这些结果表明，不仅是单细胞特性完整且功能性延长温育后，但网络活动，通过钙成像和电生理记录的评估，是不变的> 24小时postdissection。此外，我们表明，钙染料可以保留在细胞长时间，而不会造成任何有害的影响。演示此协议的应用程序，它在急性神经组织神经元的功能活性可保持长时间，一旦外部环境是高度调节。另外，作为组织的生存力，由于不同的孵育协议实验室之间变化很大，这种方法建立了应该应用，以减少在急性神经健康变性提供了理想的参数的黄金标准Ronal公司薄纸。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

下面的协议描述的C57BL / 6和C3H /他（retinally退化）小鼠神经元组织的制备中，但是类似的技术可以应用到其它物种。所有的动物是健康的，并与温度的标准条件，湿度，12小时光照/黑暗周期，自由获得食物和水的处理，并没有任何意图应力刺激。所有实验均获得批准，并按照西悉尼大学的动物护理和伦理委员会，并根据动物的使用和保养指南（动物研究机构＃A9452，＃A10396和＃A8967）进行。

1.脑片制备方法

  1. 通过异氟烷（5％）的吸入麻醉动物，并使用啮齿类铡斩首。迅速取出大脑，如前所述9，并将其放置到含有（以mM计）的冰冷的生理溶液（ACSF）:125氯化钠，2.5氯化钾，1 MgCl 2的，1.25的NaH 2 PO 4，2的CaCl 2，25的NaHCO 3，25葡萄糖，并用卡波金饱和（95％O 2/5％CO 2的混合物; 310毫渗量; pH 7.4）中。
  2. 切脑切片，在感兴趣的区域中，300微米厚的用振动切片机。
  3. 转移切片到定制孵化系统紧密监视和控制pH水平（pH为7.2 - 7.4），卡波金流量和温度如前所述10,11。
  4. 设定的初始腔室温度至35℃15 - 30分钟，然后慢慢地降低到15 - 如图1C 16℃。直到需要在孵化体系培养，然后切片，无论是电或成像。
    注:如果片被用于钙成像，请按照下列步骤操作冷却至低于室温组织之前。

2.视网膜Wholemount编制和内界膜去除

  1. 准备在任何正常的视网膜wholemounts实验室照明条件下或昏暗的红/红外光。
  2. 颈椎脱位，立即去核的眼睛安乐死的动物。使在任一埃姆斯媒体，或脑脊液含有沿锯齿缘一个小切口，和地点（mM计）:125氯化钠，25的NaHCO 3，3的KCl，2的CaCl 2，1 MgCl 2的，10葡萄糖，0.5 L-谷氨酰胺，和与卡波金饱和（95％O 2/5％CO 2的混合物;〜300毫渗量; pH 7.4）中，在RT。
  3. 立即通过沿与小剪刀锯齿缘切割和除去晶状体和玻璃体用镊子除去角膜，晶状体和玻璃体。将组织在室温孵育体系。
    注:视网膜组织可以维持在眼杯，缓慢降低温度至15后 - 16℃下，在孵化系统> 24小时，直到需要。
  4. 以除去在ILM，包含视网膜眼杯转移到含有30 U / ml的木瓜蛋白酶，1mM的L-胱氨酸，0.5毫摩尔EDTA和0.005％DNA酶在Earl's-一个小玻璃瓶平衡盐溶液（BSS）在37℃下20分钟。应用95％ 的 O 2/5％CO 2，通过该盖的解决方案，但不起泡。如果使用的是从年轻的动物（<6周）组织，稀释至半强度。
    1. 停止酶消化，通过将组织在厄尔氏BSS 10分钟的卵类粘蛋白（10毫克/毫升）与BSA（10毫克/毫升）溶液中。洗净组织温度彻底学联转移到孵化系统之前，减少到15 - 16℃。
  5. 直到需要在眼杯保持视网膜组织。转移到显微镜，隔离从眼杯视网膜和切成4片用剃刀刃。如果需要在整个视网膜上，使在视网膜的周边四个小切口以允许其平放。
    注:对于成像实验，以转移到孵化系统之前钙染料负载，见下文。

3.在孵化器中维持组织

  1. 在含有用于pH和温度测量（ 图1A，B）的探针主室放置组织。
  2. 为了辐射细菌漂浮在溶液循环脑脊液通过第二腔室（UVC室，如先前所述12构建）从主室分离并暴露于1.1W¯¯UVC灯（254纳米，5W / 2P杀菌UV灯）（ 图1A）。 30分钟，以避免学联过热 - 通过使用随机的特征，有时15和每15之间的26分钟改变接通可编程定时器控制UVC光的时机。
  3. 设置在UVC室12毫升/分钟的流速如先前报道12。覆盖UVC室用铝箔以防止该腔室，它可以破坏神经元组织以外的UVC照射。
    注:对于暗适应视网膜组织，应用定制的盖主室要排除光。
  4. 使用蠕动泵以circula德通过两个腔室的溶液（ACSF）和珀耳帖热电冷板冷却器要么冷却或加热所述主腔中的0的范围内所需的温度 - 50℃。为了获得最佳的组织培养，使用15 - 16℃的长期生存能力。

4.钙染料荷载

  1. 选择基于个体研究者的优先钙染料。这里我们使用的Fura-2AM，荧光 - 早上8点或荧光 - 凌晨4点。但是，这种方法可以应用到其它染料，以及:在DMSO溶解钙染料1mM溶液和1％的嵌段共聚物（ 例如 ，聚醚酸-127），以50微升的最终体积，并超声10分钟。
  2. 添加溶液至脑脊液至10μM，对大脑切片0.01％嵌段共聚物和20微米（视网膜），0.02％的嵌段共聚物用于在视网膜的最终浓度。在37℃（的Fura-2 AM）或在RT（的Fluo-4AM视网膜（木瓜蛋白酶处理的）和脑切片从年轻的动物，负载浴45分钟;˚F罗上午8点）。
    1. 对于成年动物，（> 12周）吸取染料（50μl），直接到脑切片，并保持75分钟，以允许染料更好地渗透到深层。
    2. 为了确保染料孵化过程中被淹没切片充足的氧气，具有封闭盖（直径2.5厘米圆形罐子，3.5厘米高）与钙染料在2.5毫升学联稀释制成玻璃装载室。用95％ 的 O 2/5％CO 2的连续充氧。没有泡沫。
  3. 继染料加载，冲洗组织与学联和转移到孵化体系，温度慢慢降低到15 - 16°C，直到实验使用。

5.电生理记录和影像

  1. 放置在显微镜下的浸没式录音室组织，并在4流速含氧脑脊液灌注 - 5毫升/分钟或在RT（〜22℃）或生理温度（〜35℃）。霍尔d。通过使用由''竖琴'定制，制成拉伸并穿过一个U形件的金或铂丝胶尼龙或金线的就位的组织。
  2. 对于电:
    1. 使用微量拉马达到5-6MΩ终阻力1.5毫米（1.19毫米）硼硅玻璃，准备记录吸管​​。
    2. 填充3吸移管-内部溶液的4微升如前所述13和可视化使用CCD照相机下红外微分干涉对比（IR-DIC）细胞。细胞内溶液应仔细针对每个实验来实现的实验结果。
    3. 位置移液管，同时保持正压力，通过上吸管保持器的吸入口加，使用一个显微细胞的细胞膜。因为在ILM已从视网膜除去，不需要事先膜刮。一旦吸管是对细胞，应用温和的负压向吸移管以实现千兆欧姆密封。然后用负压的简要量破裂细胞膜。
    4. 使用标准技术酌情全细胞电流或电压钳记录。
  3. 钙成像:
    1. 对的Fura-2的比例成像，使用超高速波长切换以提供340纳米和380纳米的激发波长。通过510±20nm的发射滤波器通过从各个细胞发出的光，并具有高灵敏度，高速数字相机捕捉。
    2. 对的Fluo-4，通过一个460过滤激发光的单个激发波长 - 通过一个515 490纳米的带通滤波器和发射的光 - 550 nm的带通滤波器。为了最快，最灵敏的记录使用高速数码相机等。按要求采集图像。
    3. 测量荧光变化作为时间的函数要么在单个波长（的Fluo-4）或使用波长比方法（的Fura-2），如先前所描述8,14。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

孵化过程中学联的细菌负载和温度的严格监管是必要的，保持神经组织活力。 16℃下（ 图1） -这可以通过与UVC光照射和维持脑脊液的温度在15进行优化。此外，脑脊液参数戳（APS; 图1C）提供实验者使用的环境条件下（pH和温度）的记录，从而培养神经元组织，其中，如果随后将减少之间变异性时，为参数的金标准实验。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

本文介绍了培养法延长急性神经组织的可行性进行成像和电生理实验，从而缩短完成实验目标所需的动物数量。两个主要过程支配神经元组织的劣化随时间:ⅰ）增加细菌水平，并在细菌内毒素伴随增加释放，和ii）随后的创伤切片过程10兴奋性中毒。为急性神经组织是环保手无寸铁，通过pH，温度和细菌水平密切监测，组织环境的紧缩调控对维持细胞活性以及网络的完整性至关重...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

致谢

We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium ChlorideSigma Aldrich VETECV800372
Potassium chlorideSigma AldrichP9333
N-Methyl-D-glucamineSigma AldrichM2004 
D-glucoseSigma AldrichG5767
Sodium bicarbonateSigma AldrichS6014
Sodium phosphate monobasicSigma AldrichS2554
Magnesium chlorideSigma AldrichM9272 
Calcium chloride Sigma Aldrich223506
Papain Dissociation SystemWorthington LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrousSigma Aldrich276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*Life technologiesP-686720% solution in DMSO 
Fura-2 AM  Anaspec84017
Fluo-4 AM  Life TechnologiesF23917
Fluo-8 AMAbcamAb142773
Vibrating blade microtome Leica BiosystemVT1200 SEquiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device 
Antivibration tableKinetic Systems Vibraplane Vibraplane 9100/9200 
Fixed Stage Upright MicroscopeOlympusBX51WI 
Microscope ObjectiveOlympusXLUMPlanFLN 20x/1.00w20X 
Microscope ObjectiveOlympusLUMPlanFLN 60x/1.00w60X
CCD CameraAndorIxon +
High speed wavelength switcherSutter instrumentLambda DG-4 
Patch clamp amplifierMolecular DevicesMultiClamp 700B
Data acquisition systemMolecular DevicesDigidata 1440AAxon Digidata® System
Borosilicate glass capillariesSutter Instrument CoBF150-86-10
Microelectrode pullerSutter Instrument CoP-97Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamberWarner InstrumentsRC-40LPLow Profile Open Bath Chambers
SoftwareMolecular DevicespClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging SoftwareAndorAndor iQ3
BraincubatorPayo ScientificBR26021976www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate CoolerTE TechnologyCP-121
Temperature ControllerTE TechnologyTC-36-25 RS232

参考文献

  1. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
  2. Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
  3. Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
  4. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
  5. Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396(2014).
  6. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588(2015).
  7. Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
  8. Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  9. Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  10. Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
  11. Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
  12. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
  13. Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
  14. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
  15. Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).
  16. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

120 AM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。