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摘要

在此，我们报告说，得到高纯度的β淀粉样蛋白42（Aβ42）和β淀粉样蛋白40（Aβ40）肽，能够形成低聚物量身定制的HPLC纯化协议。 β淀粉样蛋白在阿尔茨海默氏症牵连高度易聚集，疏水肽。该肽的淀粉样蛋白性质使得其净化是一个挑战。

摘要

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

引言

阿尔茨海默氏症是一种神经退行性疾病的全球影响超过35万人。 1在疾病的发作和发展强烈牵连，是高度易聚集，疏水肽β淀粉样蛋白（Aβ）。 2Aβ从长度36至43个氨基酸的范围内，但是，它被认为是42-氨基酸变体，淀粉样蛋白β42（Aβ42），是蛋白质的最毒的形式。 3这是由于在大多数情况下，以Aβ42的容易地形成被认为是特别神经毒性实体扩散，低聚物质的能力。 4为了进一步提供了对Aβ肽的了解，有必要定期地获得高纯度的材料。微量杂质的存在已经显示出显着改变肽的聚集倾向的属性。 五

ŧraditionally，高效液相色谱（HPLC）的疏水性肽，例如Aβ的分离已通过使用C 4或C 8的二氧化硅基固定相和酸性流动相的组合完成的。 6然而，这样的条件可以提出一个挑战的肽的纯化。所述Aβ肽的低等电点（pI约5.5）7意味着在酸性条件下，肽聚集增加，并且作为结果宽，非分辨的HPLC峰是常常难以分离产生（ 图2A）。此外，这样的宽峰常常含有可能影响所述肽的聚集的空间，通常需要后续的轮次的纯化，其可以极大地影响肽的产生量的杂质。

的聚（苯乙烯/二乙烯基苯）固定相，PLRP-S，表示PURIF的替代手段英疏水性肽。固定相已在许多不同的蛋白质和信使核糖核酸（mRNA）的的纯化被使用。 8，9 PLRP-S固定相需要用于反相分离没有额外的烷基配体，而且更重要的是化学稳定在高pH导致肽的解聚。 7在此，我们报告说，得到高纯度的β淀粉样蛋白42（Aβ42）和β淀粉样蛋白40（Aβ40）肽量身定制的HPLC纯化协议。

研究方案

1.Aβ40或Aβ42肽的制备型HPLC纯化

  1. 准备以下缓冲区的HPLC纯化。
    1. 加入1.3毫升NH 4 OH（28％溶液）到1000毫升超纯水制备缓冲液A（20毫米NH 4 OH）。
    2. 通过加入1.3毫升的 NH 4 OH（28％溶液）的800毫升的HPLC级乙腈和200毫升的超纯水的溶液中制备的缓冲液B（80％乙腈的20mM NH 4 OH）。
    3. 通过加入100微升的NH 4 OH（28％溶液）至100毫升的超纯水制备样品溶解缓冲液（0.1％的NH 4 OH）。
  2. 设置为在图1所示的高效液相色谱仪。
    1. 适合的溶剂瓶是包含缓冲A和缓冲B到HPLC泵的使用聚合物管道入口。附加聚合物管与单件式接头的HPLC泵。确保聚合物管每个缓冲器被装配到仪器的正确入口阀。契合脱气HPLC泵。
    2. 耦合HPLC泵与300埃为8μm25毫米х300毫米制备柱的入口使用聚合物管（ 图1B，最左边列中，见材料列表）。
      1. 附加聚合物管连接到制备柱上用一单件手指紧接头。确保聚合物列以正确的方式定向。
        注:制备柱的固定相由聚（苯乙烯 - 二乙烯基苯）的颗粒。该聚合物列的正确方向上标有与单个方向箭头的外壳。
    3. 使用聚合物管列的出口连接到双波长检测器和波长检测器设定至214纳米和280纳米。
      1. 在的设置仪器方法选项改变检测波长参数改变波长内置型HPLC软件。
    4. 附加聚合物管波长检测器的入口有一个单件的手指紧身。附加聚合物管连接到波长检测器的输出阀。与单件式手指紧身附加聚合物管连接到HPLC检测器的出口阀。这将是样品收集管。
      注:缺乏对Aβ肽的强烈的发色团的决定了214nm处被用作初级紫外线（UV）波长为峰集合。

figure-protocol-1026
图1:用于淀粉样蛋白β肽的纯化的HPLC仪器的实验装置。 （A）中的季HPLC泵装有一个脱气器和可变波长检测器设定至214纳米和280纳米;用于淀粉样蛋白β肽的纯化（B）的HPLC柱，从从左到右，25×300毫米2制备柱，7.5×300毫米2半制备柱和4.6×250毫米2分析柱; （C）手动进样器与用于HPLC分析20微升不锈钢注射循环; （D）的手动喷射器与用于制备和半制备纯化10mL的不锈钢注射环。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 编程性HPLC软件以运行该纯化方法如表1所示，通过改变溶剂时间表参数（在内置到HPLC软件的安装仪器方法选项）输入的纯化方法。通过点击HPLC软件的"上"按钮打开HPLC泵。
    注:该泵将开始提供缓冲液A开始比，并通过预备缓冲液Barative柱和HPLC仪器。
    1. 离开系统30分钟以充分平衡。
次/分 缓冲液A 一的％ 缓冲液B 的B％ 流量d /毫升-1分
0 80 20 6
45 75.5 24.5 6
45.01 80 20 6
52.01 80 20 6
52.02 73 27 6
85 73 27 6
92 五 95℃ 6

<强>表1:时间表使用25×300毫米聚合物列中的Aβ42和Aβ40肽的纯化。 一个缓冲A - H 2 O运用20毫米NH 4 OH; B 80％乙腈/ 20％H 2 O 20毫米NH 4 OH; Ç冉15分钟以洗涤之前样品的下一注射柱; d在为了运行上的HPLC仪器6毫升/分钟的流速，压力限制需要被降低到200巴。

  1. 该Aβ肽样品的分离纯化
    注意:通过自动固相肽合成而获得粗肽。 10
    1. 溶解3毫克粗的Aβ肽在4毫升的样品溶解缓冲液中。超声处理样品30-60■在室温下，并在40千赫兹以促进溶解的频率。
    2. 注入整个样品上用装有16号5毫升塑料注射器HPLC柱不锈钢针。如在子步骤1.3中概述运行的纯化方法。
      注:该系统使样品注入到通过使用安装有10毫升不锈钢注射环（ 图1D）的手动喷射器来完成。所需的Aβ肽将洗脱分钟72和74之间作为一个尖锐分辨峰（ 图2C）。
    3. 收集样品到50mL锥形离心管中。确认Aβ峰通过收集洗脱液直接注入质谱的身份。 11商店洗脱液为在-20℃达12小时。
      注:长于12小时没有到期的肽的氧化宜电位期间将溶液的贮藏。
    4. 隔离通过快速纯化肽冷冻收集的等分试样/液氮冷冻干燥的Aβ肽的等分试样。通过冷冻干燥该样品在-60℃，PRES的温度下进行冷冻干燥确保20毫托，为期24小时的。
    5. 运行分析型HPLC协议如下所述来确定Aβ肽的纯度。商店肽在-20℃，为期6个月的冷冻干燥的形式。

2.纯化的Aβ蛋白的分析性HPLC分析

  1. 准备HPLC缓冲区在小节1.1概述。上述协议。
  2. 设置的分析性HPLC按步骤1.2.1并且与4.6×250毫米分析柱（ 图1B，最右列），并用20微升不锈钢注入环的手动进图1所示（ 图1C）装配到仪器。
  3. 编程性HPLC软件以运行该分析方法如表2所示下列类似于在步骤1.3的指令。
时间 /分 缓冲液A 一的％ 缓冲液B 的B％ 流量/毫升-1分
0 95 五 1
三十 50 50 1

表2:时间表的Aβ肽的HPLC纯度分析。 一个缓冲A - H 2 O运用20毫米NH 4 OH; B 80％乙腈/ 20％H 2 O 20毫米NH 4 OH。

  1. 该Aβ肽的纯度分析
    1. 通过在样品缓冲液中的肽的溶解制备纯化的肽的1毫克/毫升溶液。
      注:缓冲区配方可在小节1.1中找到。蛋白质浓度通过在280nm（A 280毫微米 ）测定蛋白质的吸收来确定。 12 m个用于确定浓度OLAR消光系数（ε）为ε= 1,490分米3摩尔-1 -1。 13
    2. 注入1毫克/毫升（222μM）溶液到HPLC柱20微升并运行的分析方法，该方法是设置在步骤2.3。
      注:不用于分析剩余的溶液可以在液氮快速冷冻和冷冻干燥以回收的Aβ肽。冻干细节可以在子1.4.4节中找到。 Aβ的肽将洗脱从16和18分钟（ 图2D）之间的分析柱。使用伴随HPLC仪器来确定Aβ肽的纯度内置整合分析软件。纯度通过每个单独的峰的积分在光谱并计算肽峰面积百分比来确定。通常情况下，"95％的纯化应来确定。

figure-protocol-4756"图2"SRC ="/文件/ ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg"/>
图2:Aβ42的代表性HPLC曲线。 （A）的传统的 C 4的二氧化硅纯化，条件为:缓冲液A:H 2 O与0.1％三氟乙酸（TFA），缓冲液B:MeCN中（乙腈），0.1％TFA，梯度:20到27％缓冲液B，经40分钟，随后通过等度27％缓冲液B; （B）使用25×300毫米2聚合物列，条件制备纯化:缓冲液A:H 2 O 20毫米NH 4 OH，缓冲液B:80％乙腈/ 20％H 2 O 20毫米NH 4 OH，渐变:70分钟; 20到27％缓冲液B，接着等度27％缓冲液B; （ 三 ）优化使用25×300毫米2聚合物制备色谱柱净化，条件在位于小节协议描述文本1.3表1所示; （D）分析用HPLC使用4.6×250毫米2聚合物柱，CONDitions:缓冲液A:H 2 O 20毫米NH 4 OH，缓冲液B:80％乙腈/ 20％H 2 O超过30分钟20毫米NH 4 OH，梯度5至50％缓冲液B。对于部分A，B和C对应Aβ42峰用星号标记。标记Aβ42峰值在C部分揭示了> 95％的纯度所示部分D质谱的集合被用来确定Aβ42峰的身份。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

所述Aβ42肽的使用和PLRP-S固定相的组合的高pH的流动相在用于Aβ肽的尖锐，解析峰的形成在保留时间72和74分钟（ 图2C）之间的结果的纯化。峰的身份的确认是通过收集洗脱液直接注射质谱完成。洗脱液可以存储在长达12小时的溶液-20℃。存储的时间较长，可能会导致该蛋白质的氧化。以分离纯化的肽，洗脱剂是闪光灯在液氮中并冻干冷冻。该纯化的肽的分析型H...

讨论

所述Aβ肽的HPLC纯化是高度依赖于两者在纯化中使用的固定相和选择，以洗脱所述肽的流动相的选择。肽和高倾向聚集低等电点呈现疏水蛋白质的分离（C4或加上酸性移动洗脱液C8固定相）挑战传统色谱条件下，与Aβ肽洗​​脱作为延长的宽，非分辨峰（ 图2A）。

为了避免这个问题，PLRP-S固定相，在高pH下是化学稳定的被发现是有效的Aβ肽（ 图2B和

披露声明

作者什么都没有透露。

致谢

笔者想感谢安捷伦为他们提供技术援助。凯特·马卡姆和拉斐尔·帕洛米诺都记在合成的初始帮助纯化的Aβ肽和Hsiau伟李博士在准备手稿图1感谢他的帮助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pumpAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detectorAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loopAgilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loopAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting BracketAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptideSynthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution)Fisher ScientificA669-500
AcetonitrileFisher ScientificA998-4
HPLC grade waterFisher ScientificW5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tubeFisher Scientific14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 eaSigma-AldrichZ227250
Normject 5 cc sterile syringeFisher Scientific1481729
16 Gauge SS NeedleRheodyne3725-086

参考文献

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