CAPRRESI:通过质粒恢复和限制酶位点插入的嵌合体装配

摘要

在这里，我们通过质粒恢复和限制性酶切位点插入（CAPRRESI）提供嵌合体装配，这是基于将限制酶位点插入同义词DNA序列和功能质粒恢复的方案。该协议是一种快速和低成本的融合蛋白质编码基因的方法。

摘要

在这里，我们通过质粒恢复和限制性酶切位点插入（CAPRRESI）提供嵌合体装配。 CAPRRESI受益于原始质粒回收方法的许多优点，并引入限制酶消化以缓解DNA连接反应（嵌合体装配所需）。对于该协议，用户将野生型基因克隆到同一质粒（pUC18或pUC19）中。 在嵌套嵌合体的氨基酸序列区域的计算机选择之后，用户获得编码它们的所有同义词DNA序列。 Ad hoc脚本使用户能够确定所有同义词DNA序列。在此步骤之后，另一个Perl脚本在所有同义词DNA序列上搜索限制酶位点。该计算机分析也使用在pUC18 / 19质粒上发现的氨苄青霉素抗性基因（ ampR ）进行。用户在同义词区域内设计寡核苷酸，通过PCR破坏野生型和ampR基因。在obt之后调整和纯化互补DNA片段，进行限制酶消化。通过连接适当的互补DNA片段来实现嵌合体装配。为CAPRRESI选择了pUC18 / 19载体，因为它们具有技术优势，如小尺寸（2,686碱基对），高拷贝数，有利的测序反应特征和商业可用性。用于嵌合体装配的限制酶的使用消除了产生平端产物的DNA聚合酶的需要。 CAPRRESI是一种快速且低成本的融合蛋白质编码基因的方法。

引言

嵌合基因组装已被广泛用于分子生物学以阐明蛋白质功能和/或用于生物技术目的。存在融合基因的不同方法，如重叠PCR产物扩增¹ ，质粒回收² ，同源重组³ ，CRISPR-Cas9系统⁴ ，定位重组⁵和吉布森组装⁶ 。这些都提供不同的技术优势;例如，重叠PCR设计的灵活性，质粒恢复期间的体内选择构建体 ，或CRISPR-Cas9和Gibson系统的高效率。另一方面，在执行这些方法时可能会出现一些困难;例如，前两种方法依赖于平头DNA片段，并且这些类型的产品的连接在技术上可能与stic结扎结扎。位点定向重组可以在原始样品上留下痕迹的额外的DNA序列（疤痕），如CrelxP系统⁵ 。除了目标部位之外，CRISPR-Cas9有时可以修改其他基因组区域。

在这里，我们通过质粒回收和限制性内切酶位点插入（CAPRRESI）介绍嵌合体装配，这是一种融合蛋白质编码基因的方案，将基因质粒恢复方法（PRM）与限制酶位点插入同义词DNA序列，增强连接效率。为了确保氨基酸序列的完整性，将限制酶位点插入同义词DNA序列片段。 CAPPRESI的优点之一是可以使用普通的实验室试剂/工具（ 如酶，感受态细胞，溶液和热循环仪）进行，并且可以快速测定结果（使用适当的酶时）。依靠限制从同义词DNA序列出现的酶位点可以限制目标蛋白内部精确融合点的选择。在这种情况下，应使用重叠的寡核苷酸融合靶基因，并将限制酶位点插入到载体的抗性基因上。

CAPRRESI由七个简单步骤组成（ 图1 ）:1）选择克隆载体pUC18或pUC19 ⁶ ; 2）待融合的野生型序列的计算机分析; 3）嵌合体装配和质粒破坏的断裂区域的选择; 4） 计算机生成含有限制酶位点的同义词DNA序列; 5）将野生型基因独立克隆到所选择的质粒中; 6）通过PCR进行质粒破坏，然后进行限制酶消化;和7）使用DNA连接和细菌转化的质粒回收。应该验证这种技术产生的嵌合基因测序。

pUC18 / 19载体提供克隆和嵌合体装配的技术优势，如小尺寸（ 即 2,686碱基对），高拷贝数，有利的测序反应特征和商业可用性⁷ 。在这里，使用大肠杆菌宿主来组装和处理嵌合体，因为细菌培养物便宜且生长快。鉴于此，将需要随后将融合片段克隆到最终靶质粒中（ 例如，在哺乳动物细胞中的细菌或pCMV中的pRK415的表达载体）。

测试CAPRRESI融合两个主要的σ因子基因: 大肠杆菌D和根瘤菌（Rhizobium etlisigA） 。原始sigma因子是负责转录起始的RNA聚合酶亚基，它们由四个结构域组成（ 即 σ1，σ2，σ3和σ4） ⁸ 。氨基酸序列长度由rpoD和sigA编码的蛋白质的h分别为613和685。 RpoD和SigA共享48％的身份（98％的覆盖率）。这些主要的σ因子在区域σ2和σ3之间分成两个互补的片段。根据该设计组装两个嵌合基因:嵌合体01（RpoDσ1-σ2+SigAσ3-σ4）和嵌合体02（SigAσ1-σ2+RpoDσ3-σ4）。通过测序验证DNA融合产物。

研究方案

CAPRRESI协议

注意: 图1表示总体CAPRRESI协议。该技术基于计算机设计和随后构建期望的嵌合体。

1. 选择克隆质粒pUC18或pUC19。
   1. 选择最适合技术需求的pUC载体。
      注意:两个载体具有相同的序列，但多克隆位点的方向除外。这对于寡核苷酸的设计和PCR质粒破坏是重要的。
2. 在野生型基因和pUC18 / 19序列的计算机分析中。
   1. 获取野生型基因的DNA序列，并将其保存在FASTA格式文件（ 例如， gene.fas）中。
      注意:pUC18 / 19载体的序列包含在pUC.fas文件中（ 图1 ，步骤1）。
   2. 确定哪个限制enz通过运行REsearch.pl脚本，ymes不切割野生型基因和pUC18 / 19序列。或者，使用在线工具执行限制酶位点搜索（ 图1 ，步骤2）。
      1. 在终端中键入以下内容:
         perl REsearch.pl基因
         perl REsearch.pl pUC.fas
         注意:这些命令将创建以下输出文件:genes_lin.fas，genes_re.fas，pUC_lin.fas和pUC_re.fas。
      2. 选择适当的限制酶，通过比较genes_re.fas和pUC.fas文件，将野生型基因克隆到选定的pUC18 / 19载体的多克隆位点。选择插入物相对于pUC18 / 19载体的氨苄青霉素抗性基因（ ampR ）的方向。
   3. 设计正向和反向寡核苷酸以扩增野生型基因（外部寡核苷酸）的编码区。在每个5'端包含适当的限制酶位点的寡核苷酸;这将定义插入方向。
      1. 在正向寡核苷酸中包含功能性核糖体结合位点。
      2. 在载体内插入相同方向的两个野生型基因。
3. 选择嵌合体装配和质粒破坏的断裂区域。
   1. 通过运行translate.pl脚本获取野生型和ampR基因的氨基酸序列（ 图1 ，步骤3）。
      1. 在终端中键入以下内容:
         perl translate.pl基因
         perl translate.pl ampR.fas
         注意:此脚本将创建以下输出文件:genes_aa.fas和ampR_aa.fas。
   2. 将两个野生型氨基酸序列与适当的软件（ 如 MUSCLE）全局对齐⁹ 。
   3. 为嵌合体选择所需的断裂区域（3-6个氨基酸）基于序列比对。将它们保存为FASTA格式的文件（ 例如 ，区域 .fas）。
   4. 找到编码所选氨基酸的两个野生型基因的DNA序列。
4. 含有限制酶位点的同义词DNA序列的计算机生成。
   1. 获得编码每个氨基酸序列拉伸的所有同义词DNA序列，选择为断裂区（ 图1 ，步骤4）;这些序列存储在regions.fas文件中。
      1. 在终端中键入以下内容:
         perl synonym.pl regions.fas
         注意:此脚本将创建regions_syn.fas输出文件。
   2. 搜索同义词DNA序列上发现的限制酶位点。
      1. 在终端中键入以下内容: perl REsynonym.pl regions_syn.fas
         注意:此脚本将创建regions_syn-re.fas输出文件。
   3. 选择一种在野生型基因的同义词序列之间共享的限制酶;该网站将用于通过限制酶消化装配嵌合体。验证选择的限制酶既不切割野生型基因也不切割pUC18 / 19载体序列。
      1. 比较在genes_re.fas，pUC_re.fas和regions_syn-re.fas文件中找到的限制酶。
   4. 在两个野生型基因的相应位点处，将原始DNA替代为同义词DNA序列。将同义词DNA序列添加到野生型序列文件（genes.fas）中。
   5. 获取基因中包含的基因的氨基酸序列。文件（ perl translate.pl genes.fas ）。
   6. 对齐从野生型和同义词DNA序列翻译的氨基酸序列。验证两个序列是否相同。
   7. 用pU上存在的ampR基因重复本节的所有步骤C18 / 19载体。
      注意:目标是将ampR基因（文件ampR.fas）分解成两个互补的部分。选择用于破坏ampR基因的限制酶应与用于嵌合体装配的限制酶不同。
5. 将两种野生型基因独立克隆到选择的pUC18 / 19载体中（图1，步骤3）。
   1. 使用质粒DNA纯化试剂盒纯化所选择的pUC18 / 19质粒DNA。
      1. 例如，用pUC18质粒转化大肠杆菌 DH5α，并在37℃下在固体LB-0.3mg / mL氨苄青霉素（Amp）上生长转化体过夜。挑取转化体集落，接种新的LB-0.3mg / mL Amp板，并在37℃下生长过夜。
      2. 取部分先前的培养物，并在液体LB-0.3mg / mL Amp中在37℃下生长6-8h。使用试剂盒提取质粒DNA。
   2. PCR使用approp从整个基因组DNA扩增野生型基因对抗外部寡核苷酸。如果可能，请使用高保真DNA聚合酶。选择最大化产量的DNA聚合酶。根据制造商的指导和寡核苷酸的解链温度进行PCR。
      1. 根据DNA聚合酶，扩增子大小，模板和寡核苷酸，进行PCR循环。例如，为了扩增rpoD DNA，制备50μL的反应物:5μL的10×缓冲液， 2μL的 50mM MgSO 4，1μL的 10mM dNTP混合物，2μL的每个10μM寡核苷酸（表2），2 μL模板DNA（ 大肠杆菌 DH5α总DNA），35.8μL超纯水和0.2μL高保真DNA聚合酶。进行以下PCR循环:94℃1分钟进行初始变性，然后进行30个循环的扩增（94℃至30℃，变性30秒，寡核苷酸退火30秒，68℃退火2分钟）扩展）。
      2. 溶解1.2克通过在微波炉中加热将它们在100mL双蒸水中进行琼脂糖。组装凝胶托盘并梳理，并将其放入水平凝胶浇铸机。用熔化的琼脂糖溶液填充凝胶托盘，使其凝固。取下梳子。
      3. 将凝胶放入电泳室。用1x Tris-acetate-EDTA缓冲液填充室。将50μLPCR产物载入凝胶孔。电泳样品（ 例如 ，在110V下1小时）。
      4. 电泳后，将缓慢振荡的含有100μL1mg / mL溴化乙锭溶液的100mL双蒸水中的凝胶染色10分钟。在缓慢摇动下，用双蒸水洗涤凝胶10分钟;使用水平摇床。
         注意:溴化乙锭是一种有毒化合物;戴防护手套和棉花实验室外套。
      5. 使用试剂盒从凝胶的相应条带纯化野生型基因DNA。通过将染色的凝胶置于UV室中可视化条带（推荐波长:300nm）。保持凝胶的暴露至少。使用DNA纯化试剂盒，并按照制造商的说明进行操作。
         注意:紫外线辐射是危险的;戴防护罩，眼镜和棉花实验室外套。
   3. 根据制造商的说明书，用限制性内切酶纯化野生型基因和pUC18 / 19质粒DNA。尽可能使用快速消化酶。例如，在10μL超纯水，2μL10X缓冲液， 1μLKpn I限制酶和1μLXba I限制酶中消化6μLpUC18 DNA（300 ng /μL）。在37℃下保持反应30分钟。
      1. 根据制造商的指南禁用限制酶。例如，将80℃下的双消化反应Kpn I- Xba I灭活5分钟。
   4. 混合插入:体积比例的载体DNAo为3:1。按照制造商的说明进行连接反应。尽可能使用快速连接酶（在25℃下保持10分钟）。
      注意:通常，使用试剂盒纯化后的DNA浓度足以进行消化和连接反应。例如，加入6μL的rpoD DNA（ KpnI - XbaI ，150ng /μL），3μL的pUC18 DNA（ KpnI - XbaI ，150ng /μL），10μL的2x缓冲液，1μL的超纯水和1μLT4 DNA连接酶。在25℃保持连接反应10分钟。
   5. 用2-4μL的连接反应转化大肠杆菌 DH5α，如补充材料所述。将转化的细胞平板化成固体LB / Amp / X-gal / IPTG平板。将板在37℃下过夜。
   6. 选择白色的转化体大肠杆菌菌落，并在新的LB / Amp平板上条纹。将板在37℃下过夜/ LI>
   7. 进行菌落PCR以选择用于测序反应的候选物，如补充材料中所述。从候选物中提取质粒DNA。或者，使用用于克隆插入片段的相同限制酶的消化候选质粒DNA。
   8. 具有测序服务提供商的序列候选结构¹⁰ 。使用DNA汇编器¹¹ （ 图1 ，步骤5） 以计算机方式组装序列。
6. 通过PCR进行质粒破坏，然后进行限制酶消化。
   1. 分别设计用于野生型和ampR基因的断裂区域的硅片正向和反向寡核苷酸。将其相应的同义词DNA序列（在步骤1.4中获得）替换为野生型片段。
      注意:该同义词DNA序列含有限制酶位点。正向和反向寡核苷酸在t处重叠他限制酶位点。寡核苷酸应在21-27个核苷酸的范围内，以胞嘧啶或鸟嘌呤结束，并含有限制酶位点。正向寡核苷酸与模板DNA上的靶区域具有相同的序列。反向寡核苷酸是模板DNA上靶区域的相反互补序列。
   2. 使用两个野生型基因构建作为PCR反应的DNA模板（ 例如， pUC18 rpoD和pUC18 sigA ）。获得每个结构的两个互补部分（pUC18 rpoDσ1 -σ2，pUC18 rpoDσ3 -σ4，pUC18 sigAσ1 -σ2和pUC18 sigAσ3 -σ4）（ 图1 ，步骤6）。
   3. 将DNA样品加入琼脂糖凝胶1-1.2％[w / v]。通过电泳（ 例如 110V，1小时）将PCR产物与DNA模板分离。或者，用Dpn I消化PCR反应以破坏DNA模板。
      注意: DpnI酶仅识别甲基化DNA序列（5'-GATC-3'）。
      1. 使用DNA纯化试剂盒纯化样品。按照制造商的指导。
   4. 根据制造商的指示，用合适的限制性酶将所有互补DNA片段双重消化。尽可能使用快速消化限制酶。例如，使用Afl II和Spe I使用制造商的方案双重消化pUC18rpoDσ1-σ2DNA片段。将消化反应在37℃下保持15分钟。
   5. 根据制造商的指南禁用限制酶。例如，将Afl II- Spe I在80℃下灭活20分钟。
7. 使用DNA连接和细菌转化的质粒回收。
   1. 将合适的DNA片段以1:1的比例混合以组装所需的嵌合基因（ 图1）1，步骤7）。
      注意:以这种方式，恢复ampR基因的完整性，产生功能性蛋白质。
      1. 例如，混合4μLpUC18 rpoDσ1 - σ2DNA （用Afl II- Spe I消化，150ng /μL）， 4μLpUC18 sigAσ3 -σ4DNA（ Afl II- Spe I，150ng /μL） 10μL2x缓冲液，2μL超纯水和1μLT4DNA连接酶;试剂盒纯化后的DNA浓度足以消化和随后的连接。将连接反应在25℃保持10分钟。
   2. 用3-5μL的嵌合体装配连接反应（补充材料）转化大肠杆菌 DH5α。将LB / Amp / X-gal / IPTG板中的转化体细胞在37℃下培养过夜一夜。
   3. 选择白色的转化体大肠杆菌菌落，并在新的LB / Amp平板上条纹。在37分钟过夜C。
   4. 进行菌落PCR以选择候选物进行测序反应，如补充材料中所述。通过进行电泳（在步骤2.3.2.1中描述）可视化1-1.2％（w / v）琼脂糖凝胶中的条带。
   5. 从积极的候选人培养文化。使用质粒DNA纯化试剂盒从其中提取质粒DNA。

序列候选嵌合结构

1. 通过遵循序列服务提供商的指导，确保质粒DNA的质量对于测序反应是足够好的。使用纯化工具提取DNA。例如，在序列服务提供商的互联网页面上，请特别注意样品推荐的DNA浓度。使用DNA定量仪器获取样品的浓度。
2. 具有测序服务提供商的序列候选嵌合构建体¹⁰ 。
3. 组合se使用电脑 DNA汇编器^11进行排序读取。
4. 使用序列比对工具^9,12对齐组装和使用硅片设计的嵌合序列。验证嵌合基因是否融合成功。

做准备

注意:涉及活细胞的所有步骤都应在本生灯开启的干净的层流罩内进行。

1. 生产大肠杆菌 DH5α感受态细胞。
   1. 为了生产大肠杆菌感受态细胞，遵循已公布的方案¹³或参见补充材料 。或者，使用市售的感受态细胞。
2. 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞。
   1. 对于大肠杆菌培养物的化学转化，遵循已公布的方案class ="xref"> 13或查看补充材料 。或者，使用电穿孔进行细菌转化。如果使用市售的感受态细胞，请遵循制造商的指导。
3. 从大肠杆菌 DH5α中纯化基因组和质粒DNA。
   1. 按照补充材料中所述 ，使用市售的试剂盒或以下公开的方案进行核酸提取¹³ 。
4. 进行菌落PCR。
   1. 使用该技术鉴定候选转化体集落用于随后的测序反应。
      注意:此方法不代表序列完整性的最终验证。 补充材料中有详细的说明。
5. 准备解决方案
   1. 看到表1有关溶液制备的更多信息。
6. 下载CAPRRESI协议所需的脚本和序列文件。
   1. 下载含有所需物种完整基因组序列的基因库文件，使用基因组浏览器提取所选基因的DNA序列，并以fasta文件格式保存。下载CAPRRESI协议所需的Perl脚本。将脚本和序列文件存储在同一目录中。

结果

图1描绘了CAPRRESI。使用该方法，通过交换两个细菌原始sigma因子（ 即大肠杆菌 RpoD和R.etli SigA）的结构域来组装两个嵌合基因。使用GenBank基因组文件NC_000913和NC_007761的Artemis Genome浏览器¹⁴分别获得rpoD和sigA基因的DNA序列。从NCBI服务器的核苷酸数据库获得pUC18载体的DNA序列。通过运行REsearch.pl Perl脚本对DNA序列进行限制酶位点?...

讨论

CAPRRESI被设计为PRM ²的替代品。原来的PRM是一种强大的技术;它允许沿所选基因的任何部分融合DNA序列。对于PRM，野生型基因应该被克隆到相同的质粒中。之后，在质粒内发现野生型和抗生素抗性基因内设计寡核苷酸。通过使用平端，高保真DNA聚合酶和先前设计的寡核苷酸的PCR实现质粒破坏。互补PCR产物的连接组装嵌合基因并恢复抗生素抗性盒，导致功能质粒恢复。 PRM使得能够在...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity	Thermo Fisher	11304011	Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products
High pure plasmid isolation kit	Roche	11754785001	Used for all plasmid purification reactions
High pure PCR product purification kit	Roche	11732676001	Used for all PCR purification reactions from agarose gels
AflII restriction enzyme	New England Biolabs	R0520L	Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C
KpnI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3142L	Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C
SpeI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3133L	Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C
XbaI restriction enzyme	New England Biolabs	R0145L	Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A0166-5G	Antibiotics
Nalidixic acid	Sigma Aldrich	N8878-5G	Antibiotics
Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	Bacterial cell culture
Casein peptone	Sigma Aldrich	70171-500G	Bacterial cell culture
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	Sodium chloride
Agar	Sigma Aldrich	05040-1KG	Bacterial cell culture
XbaI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0684	Fast digest XbaI enzyme
KpnI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0524	Fast digest KpnI enzyme
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200S	Fast DNA ligation kit
AflII restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0834	Fast digest AflII enzyme
SpeI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD1253	Fast digest SpeI enzyme