测定在运动神经元样NSC-34细胞中实时测量核细胞质运输

摘要

该方案描述了一种通过量化NLS-NES-GFP蛋白的核进口的实时变化来敏感地测量运动神经元样NSC-34细胞内的核胞质转运速率的方法。

摘要

核细胞质运输是指从细胞核进入和输出大分子。最近，一些研究已经显示了肌萎缩性侧索硬化（ALS）与核细胞质通路中的损伤之间的联系。 ALS是一种神经退行性疾病，影响运动神经元，导致瘫痪，最终死亡，平均在2-5年内。大多数ALS病例是零星的，缺乏明显的遗传联系，但10％以遗传为主。最近，染色体9开放阅读框72（C9orf72）基因中的六核苷酸重复扩增（HREs）被鉴定为ALS和额颞叶痴呆（FTD）的遗传原因。重要的是，不同的群体最近提出这些突变体影响核细胞质运输。这些研究大多表明HREs对核细胞质运输的最终结果和表现，但并不表现出核转运功能障碍即时的。结果，只有严重的核细胞质运输缺陷可以被确定，主要是由于高过度表达或外源蛋白质插入。

该方案描述了一种新的非常灵敏的测定方法，用于实时评估和定量核细胞质运输功能障碍。使用荧光显微镜可以实时定量NLS-NES-GFP蛋白（穿梭GFP）的导入速率。这通过使用输出蛋白抑制剂进行，从而允许穿梭GFP仅进入细胞核。为了验证测定，使用了先前显示为破坏核胞质运输的C9orf72 HRE翻译的二肽重复序列，聚（GR）和聚（PR）。使用所述测定，与对照相比，观察到核进口率降低了50％。使用该系统，可以检查核细胞质运输的微小变化，以及不同因素拯救（甚至部分）核细胞质的能力ansport缺陷可以确定。

引言

核孔复合体（NPC）控制大分子进出细胞核的进出口。与不受调节¹进入细胞核的小分子相反，较大分子的转运受到NPC的强烈控制。这些大分子，如蛋白质和RNA，与运输因子（包括进口和出口）相关，从核心进口和出口² 。为了进口，蛋白质必须含有一个小的肽基序，通常被称为核定位信号（NLS），其由进口蛋白²约束。这些氨基酸序列用作标签，并且在组合物^{3,4 中}是不同的。由于它们与出口有关，蛋白质可以从核出口到细胞质s，其结合信号序列，通常称为核导出信号（NES） ² 。由于Ras相关核蛋白GTPase（Ran） ²的调节，进口和出口都能运输货物。 Ran已被证明存在于不同的构象状态，这取决于它是否符合GTP或GDP。当绑定到GTP时，Ran可以绑定到importins或exportins。在绑定到RanGTP后，进口商发放货物，而出口商必须绑定RanGTP，以形成与其出口货物的综合体。 Ran的主要核苷酸结合状态取决于其在细胞核（RanGTP）或细胞质（RanGDP）中的位置。

最近，一些研究显示了核细胞质通路的损伤与肌萎缩性侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD） ^{5,6 ， 7，8，9，10，11，12} 。 ALS是进行性和致命的神经变性疾病，影响上下运动神经元（MN） ¹³ ，并导致瘫痪，最终死亡，平均在2-5年内。大多数ALS分类为散发性（SALS），缺乏任何明显的遗传连锁，但10％以主要方式（家族性ALS; FALS）遗传。最近，染色体9开放阅读框72（C9orf72）基因中的六核苷酸重复扩增（HREs）被鉴定为^14,15作为ALS和FTD的遗传原因。这些突变体占FALS病例的30-40％ ¹⁶ ，不同的研究有争议它们通过影响核细胞质运输5,6,7,8,9,10,11,12造成毒性。

这些研究主要表现出HREs对核细胞质运输的最终结果和表现，但并不能实时显示核胞质中断。结果，只有严重的核细胞质运输缺陷已被评估11,17,18。

这个协议描述了一个新的和very敏感测定法实时评估和定量核细胞质运输功能障碍。使用荧光显微镜可以实时定量NLS-NES-GFP蛋白（穿梭GFP）的导入速率。如前所述，这是使用exportin抑制剂完成的，因此允许穿梭GFP仅进入细胞核。使用荧光显微镜和能够实时定量荧光变化的软件，可以量化位于细胞核中的穿梭GFP的荧光强度的逐渐变化。结果，可以制造出在任何给定时间表示核穿梭GFP的量的荧光时间轴的Michaelis-Menten样饱和曲线。通过使用曲线的初始线性速率，可以产生斜率，其表示在荧光饱和之前进入细胞核的速率。

验证测定，翻译已经报道已经报道破坏核细胞质运输的d C9orf72二肽重复序列，聚（GR）和聚（PR）被用于5,7,8,10,12。使用该测定，与对照相比，观察到核进口率降低了50％。使用该系统，可以检查核细胞质运输的微小变化。此外，可以确定不同因素拯救核细胞质运输缺陷的能力。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

细胞系制备

1. 解冻储存在液氮容器中的约1,000,000只小鼠神经母细胞瘤脊髓细胞（NSC-34细胞）。使用37°C的水培养箱，直到细胞完全解冻。
2. 加入新鲜，温和的培养基（含有10％胎牛血清（FBS），1％L-谷氨酰胺和1％pen-strep抗生素的DMEM培养基）。
3. 以500×g离心解冻细胞（SL16R）5分钟，形成细胞沉淀。弃去培养基，加入1 mL新培养基用于细胞再悬浮。
4. 将再悬浮的细胞置于15mL烧瓶中并加入额外的5mL培养基。在37℃的5％CO ₂的无菌培养箱中孵育细胞过夜。
5. 平行地，在60mm培养皿中放置8个未涂覆的盖玻片（盖玻片:12mm，0.13-0.17mm厚），并使用70％乙醇灭菌并暴露于30分钟的UV光直至干燥。向每个菜中加入培养基，处理残留的乙醇。
6. 将胰蛋白酶缓冲液（2.5g胰蛋白酶和0.2g EDTA在1升Hanks平衡盐溶液中）在达到约90％汇合（每个烧瓶约600万个细胞）后，将细胞分离。
   注意:NSC-34细胞是敏感的，并且仅使用培养基解离之前需要15秒的胰蛋白酶缓冲液温育和1分钟的无胰蛋白酶孵育。
7. 将细胞放置在已经含有盖玻片的60mm培养皿上，其中培养基为3mL，每碟约35万。将它们放在培养箱中24小时，以允许细胞附着在盖玻片上。

细胞转染

注意:大约24小时后，NSC-34细胞将达到40％汇合（约80万个细胞）并准备转染。

1. 在无菌微量离心桶中制备纯DMEM培养基（每个60 mm培养皿300μLDMEM培养基）ES。
2. 向每个含有DMEM的微量离心管中加入2μg转染所需的每种质粒。
   注意:穿梭GFP质粒在所有细胞转染中都是必需的。
3. 向所有含有所需质粒的微量离心管中加入转染试剂。在每个2μgDNA中加入4μL商业转染试剂。
4. 旋转含有DMEM，质粒和转染试剂的微量离心管，并在室温下孵育25分钟。
5. 将每个微量离心管加入培养皿中，轻轻搅拌，形成均匀的溶液。将盘放回培养箱中48小时。
   注意:由于穿梭GFP应在所有细胞中表达，穿梭GFP转染效率可以部分检查，并在过夜转染后使用荧光显微镜进行预先测试。可以使用免疫印迹分析进行非荧光表达蛋白质的全面检查是。

显微镜

1. 将含有转染的NSC-34细胞的盖玻片连接到盖玻片支架上，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻洗涤以除去分离的死细胞。
2. 使用具有倒置显微镜的绿色荧光过滤器识别合适的细胞贴片。
   注意:合适的细胞贴片被定义为显示大量细胞（场中为20-30个细胞）的显微镜视野，并且其中核在细胞中被清楚地定义。细胞膜片内的细胞核首先由眼睛识别，并由成像软件手动标记。
3. 通过在显微镜下滴加盖玻片上的缓冲液，将200μL含有10ng / mL LMB的PBS的出口蛋白-1抑制剂Leptomycin B（LMB）缓冲液加入到盖玻片中。
   注意:此时间点设置为间隔为零。
4. 将标记的核的荧光强度以3秒的间隔量化大约400-500秒。
5. 在每个单独的实验中为每个转染组测试3至5个盖板。

分析

注意:由于不同的细胞表达不同水平的荧光穿梭GFP，重要的是将每个细胞的核荧光强度归一化为其自身的初始荧光强度。

1. 通过将每个核的3s荧光间隔与该核的初始六个间隔的平均值相除来标准化标记的核的荧光强度。
2. 在每个细胞核正常化后，产生一个荧光强度曲线，代表每个细胞贴片作为时间的函数的核荧光变化。为此，计算每个细胞贴片中所有细胞的平均值（由每个贴片中约20-30个细胞组成）。
   注意:核荧光强度曲线类似于Michaelis-Menten饱和曲线，其在增加的ti内更好地观察到我的时期这是由于由于核运输而导致的随着时间的飞梭GFP的胞质量的减少。这种减少统计上降低了穿梭GFP转运到细胞核中的可能性，从而在核荧光中达到饱和。从曲线的线性初始速率得到的斜率产生进入核的V _max进入速率。
3. 使用图形软件分析从三到五个独立实验得到的每个细胞贴片的V _max斜率，以产生一个表示每个实验组的斜率。使用单因素方差分析统计分析进行定量。

蛋白质表达验证

1. 将含有残留细胞（未在上述实验中使用）的60mm培养皿从冰上每个实验组放置。
2. 处理培养基并用PBS洗涤细胞两次以稀释并洗涤剩余的培养基。
3. 用200-400处理细胞μL含有PBS，0.5％Triton和蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（PI）的裂解缓冲液。刮擦使用细胞刮刀。
4. 在微量离心管中收集裂解缓冲液中的细胞，并在匀浆器中以4000rpm在冰下均质化1分钟。
5. 将匀浆细胞以2500×g离心10分钟。收集上清液，使用Bradford测定法定量蛋白质浓度，并保存至-20°C使用。
6. 收集30-70μg总蛋白（取决于蛋白质），并将其加载到SDS-PAGE凝胶中，以使用免疫印迹法检测蛋白质表达。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

使用本文介绍的方法，用NLS-NES-GFP（穿梭GFP）蛋白转染运动神经元样NSC-34细胞。这种具有NLS和NES信号序列（ 图1 ）的蛋白质可以在细胞核和细胞质之间穿梭。通用GFP只能通过扩散而在没有任何定位信号标签的情况下进入或离开细胞核，因此分布在细胞核和细胞质之间（ 图2A ）。相比之下，由于NES和NLS信号影响其分散，穿梭GFP蛋白主要存在于细胞质...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

该方案证明了一种高度敏感和定量的新的检测方法来评估核细胞质运输的微小变化。使用该系统，可以实时观察和测量核细胞质运输及其功能障碍，不仅会导致蛋白质分布发生显着变化的大缺陷。该测定不仅具有灵敏度的优点，而且还需要很少的制备，便宜，并且是非常容易且低参与度的测定。

为了测试该系统的效率，使用了先前显示引起核细胞质运输缺陷的C9orf72蛋白，聚?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)	tebu-bio	CLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucose	Biological Industries	01-055-1A
FBS European Grade	Biological Industries	04-007-1A
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick	Bar Naor LTD
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Scientific	R0531
Axiovert 100 inverted microscope	Zeiss
Imaging Workbench 2	Axon Instruments
Leptomycin B	Sigma	L2913
PBS	Biological Industries	02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp	Glas-Col	099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002455