JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

这里我们详细介绍一种高尔基体Cox协议。这种可靠的组织染色方法允许对海马中的细胞结构和整个大脑进行高质量的评估，同时进行最少的故障排除。

摘要

树枝状突起是包含兴奋性突触的神经元树突状突起。海马内神经元树突的形态和分支变化涉及认知和记忆形成。有几种高尔基染色方法，所有这些方法都可用于确定树突状乔木的形态特征并产生清晰的背景。目前的高尔基Cox方法（商业高尔基染色试剂盒提供的方案略有变化）被设计用于评估相对较低剂量的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）如何影响树突状形态，脊柱数量以及海马内部植树的复杂程度。 5-Fu以区域特异性方式显着调节树突状复杂性并降低整个海马的脊柱密度。数据显示，高尔基染色法对CA1，CA3和海马齿状回（DG）中的成熟神经元进行了有力的染色。该协议报告每个步骤的细节，以便其他研究人员能够以高质量的结果和最少的故障排除，可靠地在整个大脑中染色组织。

引言

树突状体是接收和处理突触前输入的神经元的最大部分1 。它们的树突过程具有复杂的几何形状，其中近端分支具有比远端分支更大的直径。当树突发育时，它们在称为树突状树突的过程中与其他神经元形成几个连接。这种分支的程度和模式决定了树突可充分处理的突触输入量2 。

树突状晶化是活性依赖性可塑性和神经元回路适当发育的必需过程。延伸，收缩，分支和突触发生是复杂的过程，包括内在遗传程序和外在因素的影响。海马内神经元树突的形态和分支变化涉及认知和记忆形成3，4 ，树突状复杂性的改变与病理生理和行为变化有关5 ，异常与多种疾病状态有关，包括脆性X综合征和唐氏综合征6 。

树枝状刺是树突状乔木的特殊亚细胞层，在中枢神经系统内接受兴奋性输入。有三种形态类型的树突棘，每个类的名称根据其大小和形状:1）蘑菇棘，具有比其他刺7更复杂的突触后密度，具有更多的谷氨酸受体; 2）粗短的刺，缺乏茎;和3）薄刺，由长而窄的茎和球状头组成。树突状体积部分地用于限定它们，其中薄脊通常较小（0.01μm3 ）与蘑菇刺（0.8μm3） 9,10比较 。脊椎稳定成熟。例如，薄的脊椎在几天之后缩回或发展成蘑菇刺。或者，蘑菇棘相对稳定并且可以长时间存活。神经元连接的强度被认为是基于刺的数量和/或其体积11,12,13 。

古典高尔基染色方法及其更现代的变化对于检查树突棘形态和密度都是有用的。高尔基染色的一个独特之处在于它随机染色了约5％的总神经元，这允许追踪个体神经元14,15 。虽然高尔基甲基的确切机制od染色单个神经元尚未知，该方法的原理是基于铬酸银（Ag 2 CrO 4 ）的结晶16,17 。高尔基方法有三种主要类型:快速高尔基体，高尔基体细胞，高尔基 - 科罗奇18，19 。所有这三种方法从铬盐的初始孵化阶段开始数天至数月，但它们之间存在一定的关键差异。快速高尔基体在第一步使用四氧化锇，而高尔基Kopsch包括多聚甲醛。随后在1-2％硝酸银溶液中孵育约7天，在快速高尔基体和高尔基体系中进行染色。高尔基Cox法使用氯化汞和重铬酸钾代替硝酸银，浸渍时间为2-4周。然后将组织切片并快速置于稀释的氨中溶液，然后用照相定影剂除去盐。在三种类型中，高尔基Cox方法被认为是在没有太多背景干扰下染色树枝状树枝的最佳方法，部分原因是因为晶体表面不会发生在组织表面（不像快速高尔基法） 17，20，21 。

本方法是商业高尔基染色试剂盒提供的方案的轻微变化，并且设计用于评估相对低剂量的5-Fu如何影响树突状态特征和脊柱密度。获得的任何数据可以进一步了解化学治疗如何影响神经元电路。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

实验按照UAMS机构动物护理和使用委员会批准的道德标准进行。

动物和5-Fu注射模式

  1. 购买6个月大的雄性C57Bl6 / J野生型小鼠，并将其置于恒定的12小时光/黑暗循环下，直至达到1岁。
  2. 在0.9％无菌盐水中稀释5-Fu。使用60 mg / kg作为每只小鼠所需的剂量。
  3. 腹腔注射5-Fu（每周一次，持续三周）。
    1. 每天在同一时间内进行腹膜内注射。例如，在0900-1200小时之间。
  4. 在最后一次注射后30天安乐死动物并取出大脑。

2.安乐死程序和脑提取

  1. 禁止啮齿动物抓住尾巴的基部。另一方面，将拇指或第一根手指放在第二位e是啮齿动物颈部的基础。迅速对啮齿动物的脖子施加压力，向前推，另一只手抓住尾巴向后拉。
  2. 用一只手握住啮齿动物，另一只握住大手术剪刀。将啮齿动物的脖子放在两个刀片之间，并迅速斩首。
  3. 拿着切断的鼠标头，用精细的剪刀剪掉头骨上方的毛皮，直到眼睛。接下来，将剪刀的尖端放在每个眼窝中，轻轻地关上剪刀。
  4. 使用弹簧剪将头骨切割到小脑的左侧和右侧。
  5. 使用镊子将小脑周围的颅骨的部分直接抬起和关闭。
  6. 使用弹簧剪刀沿着头骨的中心线切割。
  7. 使用镊子将头骨的剩余部分抬离大脑。
  8. 使用刮铲和探头将大脑舀出到所需的容器中。使用不锈钢teel刀片，沿着中心位置切割每个脑。在右半球执行以下Golgi-Cox方法。

3.高尔基染色和组织制备

  1. 将新鲜收获的半脑浸入10 mL锥形管中的5 mL氯化汞基溶液（试剂盒中的溶液A）。氯化汞溶液对光敏感;用箔覆盖管。将样品在室温下保存在黑暗中。
    注意:在材料表中列出的试剂盒中提供了溶液A。警告！溶液A（也称为氯化汞溶液）含有毒性试剂如重铬酸钾，氯化汞和铬酸钾。戴防护手套，并在通风橱中工作。
  2. 1天后，将溶液缓慢倾析成临时容器（如大型称重船），并将其处理在生物危害废物容器中。将大脑（仍在原来的10 mL锥形管中）浸入5 mL氯化汞溶液，并将样品在室温下返回黑暗13天以上。
  3. 向90 mL蒸馏水或去离子水（dH 2 O）中加入30 g浸渍后缓冲液。向6孔板的每个孔中填充6.5mL后浸渍缓冲液，每个大脑一个孔
    注意:在材料表中列出的试剂盒中提供了浸渍后缓冲液。
    1. 在氯化汞溶液中14天（总共）后，用dH 2 O冲洗组织，然后将其转移到具有后浸渍缓冲液的6孔板中。用箔盖住板，并在室温下将其存放在黑暗中。
  4. 浸泡1天后取出浸渍后的缓冲液，并用新鲜的浸渍后缓冲液更新;在室温下在黑暗中储存1天。如果需要，存储在4°C最多1个月22 。

分段

  1. 在其盖子上标记12孔板，数字从左到右和从上到下按升序排列。
  2. 如果切断整个大脑，每脑准备两个或三个12孔板。
    1. 标记每个12孔板盖的顶部与脑部分的识别号码。
    2. 将2 mL 1x PBS吸取到每个板的每个孔中。
  3. 设置舞台，打开vibratome;确保容器中有足够的1x PBS以覆盖组织。
    1. 切割两片塑料石蜡膜并折叠两次。将它们放在样品支架旋钮的孔上，以防止1x PBS泄漏到计数器上。
    2. 将胶带放在样品架的组织块上，然后将氰基丙烯酸酯胶粘剂（见表格）放在上面。
  4. 从6孔板中取出大脑并将其放在塑料或玻璃皿上。使用不锈钢钢双刃刀片切断大约一半的小脑。
    1. 头尾切小脑。确保剩下的小脑部分是均匀的。
  5. 立即将剩余小脑的平坦表面放在胶上。
    注意:组织（大脑皮层）的背部部分应相对于刀片面向左或右。以前包含嗅球的前端应朝上。
    1. 等待至少几分钟，以确保胶水完全干燥。
  6. 当将大脑保持在适当位置的胶水正在干燥时，将1x PBS倒入样品池中。胶水干燥后，将样品架放入样品池中。
    1. 如果组织样本没有完全覆盖，则将更多的1×PBS倒入样品池中。
  7. 将刀片连接到振动片的刀架上，慢慢地l将刀片放入样品池中，直到其完全浸没在1x PBS中。继续降低刀片，直到其稍低于组织的顶部。
  8. 将振动速度设置为7，振幅为6，切割角度为12°（参见表的材料为vibratome型号）。启动振动并切割200微米的部分23 。
    1. 使用大型画笔将组织切片从样品池移动到12孔板的每个指定的孔中。
  9. 继续切割组织直到达到所需数量的组织切片。

后染色

  1. 对于以下每个染色步骤和冲洗液，每孔使用2 mL所示溶液。使用电动移液器填料（参见表格）将溶液转移到孔中。使用转移移液器（参见表格）将溶液从井中转移到适当的废物中容器。
  2. 在0.01M PBS-T（加入3.0mL洗涤剂（参见表格物质））至1,000mL 0.01M PBS中的一个30分钟洗涤中冲洗切片。
  3. 稀释氢氧化铵溶液（注意事项）立即使用前用dH 2 O容积3:5。将稀释的氢氧化铵溶液中的切片染色19-21分钟。
    1. 用箔保护光敏氢氧化铵溶液。
      注意:溶液中的氢氧化铵浓度为〜10％，被归类为"危险"。如果氢氧化铵溶液接触皮肤，可能会产生灼伤。吸入可能引起呼吸道刺激。戴防护手套，并在通风橱中工作。
  4. 染色后染色缓冲液中的切片（在500 mL dH 2 O中加入90 g试剂D）19-21分钟。后染色缓冲液是光敏感的;用箔22保护它。
  5. 冲洗三部分，洗涤5-10M PBS-T。

6.安装，清洁和覆盖

  1. 用大画笔在1％明胶涂层的载玻片上安装切片。让它们在室温下干燥20-30分钟，然后将其置于Coplin罐中过夜。
  2. 从Coplin罐中取出戴手套的幻灯片，并将它们放在塑料支架中（参见表格）。将塑料架置于含有100％乙醇的染色盘（见表格）中。用三次洗涤5分钟使其脱水。
  3. 每次在99％二甲苯中洗涤载玻片两次，每次5分钟。将载玻片放置在玻璃架中，并将机架放入含有金属把手的二甲苯的玻璃染色皿中（参见表格）。
    注意:注意，二甲苯吸入有害，如果接触皮肤，会引起刺激。它在液体和蒸气状态下是高度易燃的。戴防护手套，并在通风橱中工作。
  4. 从xyl中取出幻灯片一次一个，并用〜0.25 mL的安装介质快速覆盖组织（参见材料表）。接下来，把幻灯片盖子放在媒体上。
    1. 将滑盖的下方的任何被困的气泡用钝器（如画笔的末端）推到边缘。
  5. 将幻灯片放置在远离阳光的地方，让它们干燥2-3天。
  6. 继续使用显微镜获取图像，并使用适当的软件进行分析。

7.获取图像堆栈

  1. 打开成像程序（参见材料表 ）。将幻灯片放置在显微镜的舞台上。在程序顶部的菜单上，单击"获取"，然后单击"实时图像"。
  2. 将显微镜设置为10X。识别偏好的神经元，然后将光标（如红色X）移动到索马里的中心。左键单击设置参考点。
  3. 将显微镜设置为40X。从程序顶部的菜单中单击"移动"，然后单击"到参考点"。
  4. 开始创建图像堆栈，手动滚动组织上方的细微物体，直到它稍微偏离焦点。
    1. 点击程序右下角"图像采集"标题下的"设置顶部"。
    2. 稍稍滚动一下纸巾，直到它略微偏离焦​​点，然后点击"图像采集"下的"设置底部"。接下来，点击"获取图像堆栈"。
  5. 获取图像堆叠后，在出现的窗口中输入图像文件所需的名称。另存为"MBF Ascii文件"。
    1. 出现提示时，选择文件类型为"MBF JPEG2000堆栈文件"，然后单击"保存"。

神经元追踪

  1. 在工具栏r在菜单下方，单击标题为"轮廓名称"的框。从下拉菜单中选择"Soma"。
  2. 手动追踪索马然后右键单击并选择"完成单元格主体"，当跟踪完成。
  3. 选择"AutoNeuron"以显示另一个标题为"AutoNeuron Workflow"的标签。
  4. 在"配置类型"下，选择"新建"。设置参数，然后单击"下一步"以显示"Soma Detection"子标题。
    1. 要设置参数，请选择"Brightfield"。接下来，在"最大工艺直径"下，单击"开始测量"。使用光标，转到树枝的底部并手动设置直径。
  5. 在请求用户跟踪整个图像的窗口中单击"是"。手动追踪索马单击"下一步"，打开"种子放置"子标题。
  6. 点击"验证种子"s"，然后点击"下一步"提出"神经元重建"副标题。
  7. 在"神经元"下，点击"互动"。执行交互式跟踪，遵循树突程序的方向，右键单击以完成程序跟踪的突出显示区域。跟踪所有树突后，单击"下一步"。
  8. 出现新窗口后，保存具有所需标题的新配置。点击"保存"。

9.分析

  1. 打开分析程序（参见材料表）。
  2. 单击顶部菜单中的"文件"，然后单击"打开数据文件"。选择感兴趣的文件。
  3. 在分析小标题下，选择"分析"。
  4. 在"Sholl Analysis"窗口中，将起始半径设置为10μm。在"分析"下，单击"树枝"和"分支订单"框。
  5. 右对齐ick新打开的窗口，然后单击"Excel导出"。点击"保存"。
  6. 在分析下，点击"分支结构分析"。选择"所有可能的分析"。
  7. 右键单击新打开的窗口，然后单击"Excel导出" 24 。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

使用市售成像软件量化5-Fu处理对高尔基染色脑切片海马树突状结构和复杂性的影响。在追踪后，使用Sholl分析和树突复合指数（DCI）分析树突状树枝状结构，脊柱密度和脊柱形态。 Sholl分析是一种定量分析方法，可用于确定树枝状心轴形态25 。从soma开始，距离彼此相隔10微米的圆圈覆盖树突状迹。枝晶的长度取决于枝晶交叉的圆数。分支点分析，一种确?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

与更现代的技术相比，高尔基Cox方法具有几个优点，使其成为检查脊柱形态的首选方法:1）染色可用于基本上任何组织，2）基本的光学显微镜设置是所有需要的获得基于高尔基体的图像，3）高尔基Cox成像比共焦成像更快; 4）高尔基染色切片比荧光标记的样品长达数月至数年。即使有这些优点，高尔基Cox方法仍然有一定的局限性。首先，整个过程非常耗时，需要几周的染色，然后分析图像。如本协...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

致谢

这项工作得到NIH P20 GM109005（ARA）和转化神经科学中心IDeA计划奖P30 GM110702的试点资助。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
superGolgi Kit Bioenno Lifesciences30100 Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrateFisher BP665-1
Triton X-100Sigma9002-93-1
Permount Fisher SP 15-100
Slide cover Fisher 12-546-14
7 mL Transfer pipette Globe Scientific 135030
10 mL Falcon tubes BD Biosciences 352099
Foil Fisher 01-213-105
12-well plate BD Biosciences 353043
200 proof Ethanol Pharmco-AAPER111000200
Xylene Acros Organics 1330-20-7Hazardous. 
Permabond 200Permabond LLCGF2492
25 mL serological pipetteSigmaSIAL1489
ParafilmMidsciHS234526C 
Vibratome World Precision Instruments NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice The Jackson Laboratory 000664
Axio Imager 2ZEISSMultiple components, see website for details. 
AxioCam MRc CameraZEISS426508-9902-000
Staining Dish , GreenTissue-Tek62541-12
Staining Dish Set Electron Microscopy Sciences 70312-20
Motorized Pipet Filler Fisher 03-692-168
Neurolucida mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer mbf Bioscience 
Prism GraphPad

参考文献

  1. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
  4. Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
  5. von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
  6. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  7. Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
  8. Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
  9. Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  10. Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
  11. Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
  12. Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
  13. Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
  14. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  15. Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24(2013).
  16. Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
  17. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
  18. Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
  19. de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).
  20. Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
  21. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
  22. superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
  23. Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
  24. Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
  25. Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  26. Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  27. Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
  28. Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
  29. Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
  30. Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
  31. Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
  32. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。