分离的原发性上皮细胞从附睾的全细胞贴片钳记录

摘要

我们提出了一种协议，结合细胞分离和全细胞膜片钳记录来测量主要解离的上皮细胞从大鼠cauda附睾的电性质。该方案允许研究原发性附睾上皮细胞的功能特性，以进一步阐明附睾的生理作用。

摘要

附睾是精子成熟和生殖健康的重要器官。附睾上皮由复杂连接的细胞类型组成，不仅在分子和形态特征上而且在生理特性上都是不同的。这些差异反映了其各种功能，它们共同为睾丸内附睾精子发育建立必要的微环境。了解附睾上皮细胞的生物物理特性对于在生理和病理生理条件下显示其在精子和生殖健康中的功能至关重要。虽然其功能特性尚未完全阐明，附睾上皮细胞可以使用膜片钳技术进行研究，膜技术是测量单细胞的细胞事件和膜性质的工具。在这里，我们描述了细胞分离和全细胞膜片钳记录方法确定主要解离的上皮细胞从大鼠cauda附睾的电性质。

引言

男性生殖道的附睾是一层衬有一层马赛克上皮细胞的器官。如在其他上皮组织中，附睾上皮的各种细胞类型，包括主要细胞，透明细胞，基底细胞和来自免疫和淋巴系统的细胞，以协调的方式起作用，作为小管前线的屏障，并且作为支撑为精子成熟和生理学^1，2，3的细胞。因此，这些上皮细胞在生殖健康中起重要作用。

上皮细胞通常被视为不可兴奋细胞不能产生响应全或无动作电位去极化到刺激，由于缺乏电压门控Na ⁺或Ca ²⁺通道^4,5。然而，上皮细胞表达uni一组离子通道和转运蛋白调节其特殊的生理作用，如分泌和营养物质运输⁶ 。因此，不同的上皮细胞具有特征的电性质。例如，主细胞表达的CFTR用于流体和氯化运输和表达对钙的重吸收的TRPV6，而明确细胞表达质子泵V-ATP酶对于管腔酸化^{1，7，8，9。}调节附睾上皮细胞的生理特征的一些转运蛋白和离子通道已被报道，但附睾上皮细胞的功能特性在很大程度上尚未了解^{10，11，12，13。}

瓦油细胞膜片钳记录是用于检查可兴奋细胞和不可兴奋细胞的固有特性的已知技术，特别有助于研究异源细胞样品中主要解离的细胞的功能;电压钳用于测量无源膜特性和单电池^14，15的离子电流。被动膜性质包括输入电阻和电容。前一个参数表示内在膜电导，而后者则表示细胞膜的表面积（磷脂双层，其中离子通道和转运蛋白位于其中，其作为分离细胞外和细胞内介质的薄绝缘体）。膜电容与细胞膜的表面积成正比。与输入电阻反映的膜电阻一起，膜时间常数w可以确定细胞膜电位对离子通道电流的流动有多快。在这点上，由电流响应特性从一系列施加于细胞电压的步骤相结合，生物物理动力学和细胞的性质被确定^{15，16，17，18。}

在本文中，我们描述了使用全细胞膜片钳从大鼠cauda附睾分离上皮细胞的程序和用于测量解离的细胞混合物中不同细胞类型的膜性质的步骤。我们显示附睾主细胞表现出不同的膜电生理特性，并且可以容易地从其他细胞类型鉴定电导。

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研究方案

所有动物实验均按照符合当地和国际要求的上海科技大学机构动物护理与使用委员会的指导方针进行。

实验动物

1. 使用8-12周龄的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（约300-450g）。在大鼠的这个年龄，精子已经到达了马尾附睾。

2.大鼠Cauda上皮细胞的分离

注意:除非另有说明，以下步骤在非无菌条件下进行。

1. 准备解剖仪器和试剂
   1. 通过浸泡在70％乙醇中并使其风干来消毒解剖工具。
   2. 打开温水浴（32°C）;准备并预热500毫升1x Roswell Park纪念研究所1640培养基（RPMI），补充1％（v / v）抗生素（100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素最终），标记为"RPMI（+ P / S 1:100）"。在清洁的气流控制工作站中执行此步骤。
   3. 准备并预热1x 500mL含有非必需氨基酸（0.1mM）和丙酮酸钠（1mM）的Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM），并补充有5-α-二氢睾酮（1nM），10％胎牛血清，1％（v / v）抗生素（100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素最终），并标记为"全IMDM"。创建50 mL等分试样并用石蜡膜密封;储存于4°C。使用无菌条件。
   4. 通过将胶原酶I型和II型胶原酶溶解在RPMI（+ P / S 1:100）中制备胶原酶消化溶液，得到溶液中每个胶原酶1 mg / mL。过滤0.22μm膜，标记为"胶原酶溶液"。保持在室温（RT）直到使用。调整酶溶液的体积关于酶的重量;来自单一大鼠的马尾uda附睾剂所需的最小体积为2 mL。
   5. 用RPMI（+ P / S 1:100）填充35毫米的盘子。
2. 解剖大鼠马尾附睾
   1. 通过使用戊巴比妥钠85mg / kg ip或使用异氟醚室来灭绝动物，直到动物对尾部刺激刺激不起反应;遵循颈椎脱位。
   2. 用70％乙醇擦拭消毒下腹部，轻轻将两只睾丸推至下腹部，然后打开阴囊附近的下腹部。
   3. 拿起附睾脂肪，解剖出整个生殖器官（睾丸，附睾和输精管），并用RPMI（+ P / S 1:100）浸泡在盘中。
   4. 将RPMI（+ P / S 1:100）的生殖器官转移到无菌工作站。
   5. 从结缔组织和脂肪组织和表皮解剖出马尾附睾干燥胶囊。将一个附睾与约0.2mL的胶原酶溶液置于1.5mL管中。在干净的气流控制工作站中进行此步骤。
3. 单细胞从大鼠马尾附睾的分离
   1. 使用精细剪刀切割胶原酶溶液中的附睾，直到组织变成糊状液体。用1.5 mL管中的其余（〜0.8 mL）酶溶液轻轻冲洗剪刀。
   2. 将管放置在金属温热混合器上，在37℃下振荡速度为1000rpm。
   3. 将酶组织混合物在室温下以30xg离心3分钟，并倾析出主要含有精子的粘性上清液。
   4. 将沉淀重悬于1mL Full-IMDM中以淬灭所有的酶活性。将细胞悬浮液转移到含有49mL RPMI（+ P / S 1:100）的50mL管中。
      注意:任选地，通过具有恒定曲线的100μm网眼膜过滤细胞悬浮液离子以避免大的细胞聚集。然而，如果需要细胞悬浮液用于生长细胞单层，则不要使用网状过滤器。
   5. 将细胞混合物在室温下以30xg离心10分钟;倾倒上清液。
   6. 将沉淀重悬于1mL Full-IMDM中，温和研磨至少5分钟，以从酶处理的附睾组织混合物中解离单细胞。
4. 在无菌条件下从其他细胞中分离上皮细胞
   1. 在含有Full-IMDM的10cm培养皿上培养细胞悬浮液至少8小时或过夜，在32℃，5％CO ₂的培养箱中培养。
   2. 通过浸入100％酒精中预先准备无菌盖玻片。空气干燥并浸入少量的培养基中。将盖玻片放在6厘米培养皿或24孔板的单孔中。
   3. 第二天早晨，通过轻轻收集细胞悬液来收获解离的上皮细胞培养皿主要由上皮细胞组成。将细胞悬浮液在室温下以30xg离心5分钟，然后倒出上清液。
   4. 将细胞沉淀重悬于〜2mL全IMDM。
   5. 将0.2mL收获的细胞悬浮液种植到每个无菌盖玻片的中心。
   6. 让细胞悬浮液沉淀在液滴中至少10分钟，以使细胞松散地粘附到玻璃盖玻片上。小心地在10厘米盘的边缘加入1毫升的全IMDM，或在24孔板的每个孔中加入0.3毫升的全IMDM;不要打扰细胞。
   7. 将分离的单个细胞在培养箱中的盖玻片上，在32℃，5％CO _2中直到膜片钳实验。

3.记录解决方案和微量移液器

注意:对于膜片钳实验，请使用最优质的化学品和解决方案。

1. 准备库存解决方案
   1. 高压灭菌所有的瓶子库存储存和过滤所有的库存溶液（腐蚀性溶液除外），并在使用前过滤0.22μm膜。
   2. 在室温下预先准备所有储备溶液，并储存在4 ^o C:5 M NaCl; 1 M KCl; 100mM MgCl ₂ ; 100mM CaCl ₂ ; 200mM NaH ₂ PO ₄ ; 100mM EGTA（pH7.0，用KOH）。处理5 M NaOH，1M HCl和1M KOH储备液作为腐蚀性溶液。
2. 制备标准外用生理盐水溶液（PSS）
   1. 在膜片钳记录的早晨，将库存溶液温热至RT。
   2. 除CaCl _2外 ，根据所需的最终体积吸取各种成分， 例如制备500 mL PSS:140 mM NaCl = 14 mL 5M; 5mM KCl = 2.5mL的1M; 1.2mM MgCl ₂ = 6mL 100mM; 1.2mM NaH ₂ PO ₄ = 3mL 200mM。
   3. 添加双倍去离子水（ddH ₂ O）至最终体积为400mL并平衡。
   4. 称量0.9 g葡萄糖和1.19 g HEPES，并完全溶解在溶液中。
   5. 在搅拌下加入CaCl ₂原料（2.5 mM = 12.5 mL，100 mM）。
   6. 最多可达99％。
   7. 使用NaOH或HCl将pH调节至7.4。
   8. 检查渗透压，并根据需要使用5 M NaCl或葡萄糖进行调整。
   9. 在圆筒中加入ddH ₂ O至最终体积为500 mL。
3. 微量移液器内部溶液的制备（低EGTA K ⁺溶液）
   1. 根据所需的最终体积和浓度称量或移取每种试剂的正确体积， 例如用于制备50 mL低EGTA K ⁺的细胞内溶液至体积约30 mL ddH ₂ O:100 mM K-葡萄糖酸盐= 1.17g; 35mM KCl = 1.75mL 1M; 2mM MgCl ₂ = 1mL100mM; 0.1mM EGTA = 0.05mL的100mM; 10mM HEPES = 0.072g。
   2. 加入最终体积的约95％的足够水，并使溶液在室温下平衡。确保解决方案清晰。
   3. 在不断搅拌溶液的同时，用KOH调节pH至7.2。
   4. 称量并向溶液中加入0.078 g Mg-ATP，直至溶液完全溶解。
   5. 将溶液置于冰上，并使用少量等分试样测量渗透压;通常，解决方案可测量〜290 mOsmol，不需要调整。如果渗透压与280-295 mOsmol显着不同，请制备新的溶液。
   6. 将ddH ₂ O添加到最终体积。
   7. 将溶液分成500μL等分试样，用0.2μm注射器过滤器过滤，密封并立即保存在-20°C。
   8. 在膜片钳实验之日，将一半的细胞内溶液在冰上解冻，并在膜片钳实验期间保持冷冻防止退化。
4. 从玻璃毛细管拉出补片移液器（使用移液器拉拔器用户手册），以获得当充满细胞内溶液时具有5-10M电阻的微量移液器尺寸。

4.设置补丁夹实验，建立细胞全细胞配置

1. 设置膜片钳实验
   1. 打开膜片钳设置（电脑，电脑控制放大器，数字化仪等 ）
   2. 打开补丁钳软件（ 例如 AXON pCLAMP10或HEKA PatchMaster），并设置电生理记录协议。将信号滤波器设置为1-3 kHz的低通，数字转换器设置为10-20 kHz。
   3. 打开相机，显微操纵器和光源。
   4. 当计算机控制放大器打开时，通过用手接触实验者的身体接地的贴片钳，在触摸前台之前，为了保护它免受电击。
   5. 将玻璃盖玻片上的培养上皮细胞转移到装有〜1mL标准PSS的记录室中。在进行膜片钳实验之前，使用移液器至少两次更换沐浴PSS。
      注意:可选，根据计划的实验，使用标准PSS或其他外部溶液填充灌注系统。在开始进行膜片钳实验之前，以〜2 mL / min的速度将显微镜安装的记录室（RC-26G或RC-26GLP）与PSS进行几次。确保灌注系统中没有气泡被捕获。
   6. 使用配有差分干涉对比度光学系统的10X和40X物镜在倒置显微镜下查看并选择细胞。寻找大型单独的细胞进行记录。通过粗糙m的球形识别孤立的附睾上皮细胞微绒毛在膜的一端和细胞内含量的极化分布（ 图1 ）。
   7. 使用1 mL注射器（自制的非金属微量注射针），用内部溶液（低EGTA K ⁺溶液，参见步骤3.3）填充微量移液管。确保微量移液管中没有气泡，这可能会增加微量移液器的阻力。使用足够的溶液，使内部溶液将氯化物涂覆的银线电极浸入微量吸管支架内。
   8. 将微量移液管安装在电极夹中，并施加低正压（〜0.2 mL注射器体积）。保持低正压连续，直到在后续步骤中接触细胞膜。
2. 用记录单元建立全单元配置
   1. 以最高速度的微操纵器将移液器浸入浴液中。找到移液器提示在屏幕上连接数码相机;将显微操纵器速度降低到中高档模式。
   2. 使用数据采集接口命令（ 例如 AXON系统中的"膜测试"），通过施加从计算机控制的放大器产生的电压步长（ 例如， 5毫秒为100毫秒），快速检查微量移液器电阻（5-10MΩ）。如果电阻显着超出此范围，请更换为新的微量移液器。
   3. 开始向下移动显微镜上安装的物镜;逐渐将微量移液管引向选定的细胞。首先要降低目标，然后将微量移液器降低到焦平面，直到微量移液管位于所选细胞的中心表面之上。
   4. 使用软件的命令器界面中的"pipette offset"命令，将移液器和液体溶液之间的液体接点取消为零。
   5. 设置计算机控制放大器通讯安装到电压钳和膜测试到"Bath"模式。
   6. 精细对焦以更清晰地观察细胞，然后在低中速度下使用显微操纵器逐渐降低微量移液管。
   7. 当微量移液管接近细胞时（通过膜测试指令触发时由电流降低证明），立即取出低正压，施加弱负压（0.1 mL注射器体积）以形成igaseal（> 1GΩ） 。
   8. 用膜测试监测电阻。如果电阻> 500MΩ但<1GΩ，则施加负电位（通常作为保持电位设置为-60 mV），这有助于形成gigaseal。补偿微量移液器的瞬态电容电流。
   9. 如果密封件> 1GΩ并且稳定（如软件界面所示），请施加简短强力的吸力以破坏细胞膜。不要赔偿本金电阻和电池电容。
   10. 在达到成功的全细胞配置之后，立即从-60mV的保持电位施加10mV超极化步骤（具有最小时间间隔，20ms持续时间，20kHz的信号样本的5个走线）。
   11. 将电压模式切换到零电流模式，并标记软件界面的读数，或对电池的膜电位读数执行无间隙记录（10-60秒）。
   12. 快速切换回并保持在电压模式，并根据计划的实验应用电压协议，并测量当前响应。在记录期间，减法不适用于本征泄漏电流。
   13. 监视记录期间响应的稳定性或单元格的不同参数。例如，使用"膜测试"命令界面来检查输入电阻（R _i ），串联电阻（R _s ）和电池薄膜电容（C _m ）在薄膜测试期间在"Cell"模式下的协议切换。
       注意:输入阻力的突然下降通常表示松散的贴片，并且串联电阻的显着增加可能指示微量移液管尖端被细胞内细胞器或膜片段堵塞。在录制过程中，定期监测微量移液器位置，以检查是否发生漂移，这可能会导致补片丢失。如果漂移是一个问题，请小心地将微量移液管和修补池一起提起，远离记录室底部。这个步骤有时可能会导致贴剂的损失，在这种情况下，有必要重复全细胞膜片钳制程序。

5.细胞被动电生理特性分析

1. 在从膜片钳实验中获得数据后，在Clampfit软件中打开无间隙数据并测量平均值每个细胞的静息膜电位的值。或者，使用在当前模式下从零电流电压标记的值。校正具有液体结电位的值（本研究中为12.4 mV）。
2. 打开来自从细胞得到的10毫伏超极化步骤（ΔV）的数据，之前和期间的步骤测量电流差（Δ 我 _步骤 ），并计算使用下式作为输入电阻（R _I）:
   
3. 计算电池电容（C _m ，以pF为单位）（使用与10 mV超极化步骤相同的电流数据，通过在电压阶跃触发时初始瞬态衰减电流下积分膜电容电流下的总面积）以获得单元的总累积电荷（Q，单位为pA·ms）的值。使用以下公式:
   
4. 通过使用标准指数算法拟合10 mV负步骤的初始瞬态电流，计算每个单元的串联电阻（R _s ）的值，以获得时间常数衰减电流（ T ，单位为ms），并使用以下等式:
   

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结果

对于上皮细胞从大鼠马尾附睾隔离所描述的酶消化过程是从我们以前的研究^9,12一个经修改协议。该方法产生具有超过90％存活力和无表面起泡或肿胀细胞体积的单细胞混合物。异质细胞混合物主要由主要细胞，透明细胞和基底细胞组成，如前所述¹ 。在该方案中，可以通过在培养皿上培养主要解离细胞过夜以获...

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讨论

在该方案中，大鼠卡达附睾的酶分散始终产生健康的上皮细胞。用于膜片钳实验的附睾上皮细胞的质量取决于方案中的几个关键步骤。例如，在低离心力（30×g）下离心细胞混合物对于去除精子和附睾腔内含量是重要的;附睾上皮细胞在细胞培养中精子存在时变得不健康。另外，在培养皿上培养解离的细胞混合物数小时是去除成纤维细胞和平滑肌细胞的重要步骤;非上皮细胞在培养皿上粘附更快，因...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier	Molecular Devices - Axon	Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system	Molecular Devices - Axon	Digidata 1550 converter
Microscope	Olympus	BX-61WI
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier	Harvard Bioscience - HEKA	EPC-10 USB double
Microscope	Olympus	IX73
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Recording chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Recording Chamber	Warner Instruments	RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament	Sutter Instrument / Harvard Apparatus	BF150-86-10
Vibration isolation table	TMC	63544
Digital Camare	HAMAMASTU	ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium	Gibco	22400089
Penicillin/Streptomycin	Gibca	15140112
IMDM	ATCC	30-2005
IMDM	Gibco	C12440500BT
Collagenase I	Sigma	C0130
Collagenase II	Sigma	C6885
5-α-dihydrotestosterone	Medchemexpress	HY-A0120
Fetal bovine serum	capricorn	FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM	Sigma/various	V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM	Sigma/various	M2393
EGTA, 0.1mM	Sigma/various	E4378
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
K-gluconate, 100mM	Sigma/various	P-1847
Mg-ATP, 3mM	Sigma/Various	A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM	Sigma/various	V900058
KCl, 4.7mM	Sigma/various	V900068
CaCl2, 2.5mM	Sigma/various	V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM	Sigma/various	M2393
NaH2PO4, 1.2mM	Sigma/various	V900060
HEPES, 10mM	Sigma/various	V900477
Glucose, 10mM	Sigma/various	V900392
For pH adjustment
NaOH	Sigma/various	V900797	Purity >=97%
KOH	Sigma/various	60371	Purity >=99.99%