JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

该方案的目的是证明新生儿鼠耳蜗外植体的制备，培养，治疗和免疫染色。该技术可用作听力研究中的体外筛选工具。

摘要

虽然在过去几十年的听力研究方面取得了显着的进步，但仍然没有治疗感觉神经性听力损失（SNHL），这种情况通常涉及损伤或丧失内耳微妙的机械感觉结构。近年来出现了复杂的体外和离体测定，能够筛选越来越多的潜在治疗性化合物，同时最大限度地减少资源并加快努力开发SNHL的治疗。虽然某些细胞类型的同源文化在当前的研究中继续发挥重要作用，但许多科学家现在依赖于更复杂的鼠内耳的器官型培养物，也称为耳蜗外植体。内耳中有组织的细胞结构的保存促进耳蜗基础设施的各种成分的原位评估，包括内外毛细胞，螺旋神经节神经元，神经元ites和支持细胞。在这里，我们介绍新生儿鼠耳蜗外植体的制备，培养，治疗和免疫染色。仔细准备这些外植体有助于识别有助于SNHL的机制，并为听力研究界提供宝贵的工具。

引言

感觉神经性听力损失（SNHL）反映内耳损伤或上升听觉通路。听力损失是人类最常见的感觉缺陷1 ，疗效尚不存在2 。虽然耳蜗或听觉脑干植入物可以恢复对严重到深刻的SNHL的患者的某种程度的听力，但是由这些装置提供的听力仍然与"自然"听觉非常不同，特别是在理解噪音或听音乐的尝试期间。

虽然毛细胞变性长期以来被认为是创伤性听觉事件（ 例如暴露于大声）的主要后果，但越来越多的证据表明，将信息从毛细胞传播到听觉神经的突触至少与声学创伤一样容易3 ， 4，5 > ， 6 。由于人类听力阈值，目前用于评估听力功能的黄金标准，不预测内耳特异性细胞损伤，需要更精细的工具来尽快检测细胞变性并开始适当的治疗7 。

听力损失的有希望的药物治疗通常在体外在同质细胞培养物上测试，但是这样的系统不能准确地模拟人工耳蜗的微环境。已知耳蜗细胞分泌影响耳蜗内其他细胞类型的营养因子8,9 ，当Corti 10,11或螺旋神经节神经元（SGN） 12的器官被隔离培养或当时分析分子标记然而， 对 体外数据验证可能需要的体内研究可能需要大量的资源和时间，这在体外数据验证方面需要大量的资源和时间，这在考虑时尤为重要需要多少努力才能完成和进行听力测试的中耳或圆窗膜注射和随后的人工耳蜗解剖。有效筛选被称为耳蜗外植体的器官型离体培养物中有希望的化合物提供了经济和可靠的替代物14，15，16，17 。

本文详细介绍了一种用于产生，维护和评估治疗耳蜗外植体的方案。强调了该模型的具体应用，包括其在筛选中的应用的潜在治疗化合物和用于基因治疗的病毒载体的比较评估。 离体外植体方法允许研究人员将给定治疗对原位不同细胞群体的影响视觉化，促进细胞类型特异性机制的鉴定和随后的靶向治疗的改进。

总的来说，这种技术提供了一种离体研究耳蜗的模型，同时保持耳蜗内共存的巨大不同细胞类型之间的重要串扰。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

研究方案由马萨诸塞州眼科和耳朵的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。根据世界医学协会道德守则进行实验。

1.准备解剖

  1. 准备手术台
    1. 使用70％乙醇消毒手术台。
    2. 在显微镜旁边放置两个无菌制剂垫。
    3. 准备仪器托盘，包括热灭菌的操作剪刀，手术刀手柄，微型刀和镊子（＃4＃＃两个）。将仪器托盘和一个50毫米，透明玻璃的玻璃培养皿放在一个非消毒垫上。
    4. 获得无菌＃15手术刀刀片;可密封的塑料袋或容器（根据制度准则处置屠体）;一桶冰和冷的，无菌的汉克平衡盐溶液（HBSS）。将这些物品放在其他无菌垫。
    5. 将HBSS转移到50 mL塑料实验室管中，并放在冰上。
  2. 准备文化
    1. 准备层流罩中的所有材料。对于每四个样品，将四个高压灭菌的10毫米圆形玻璃盖玻片放入35毫米4孔培养皿的四个镶嵌中。
    2. 对于每4个样品，将总量为300μL的微量混合物在微量离心管中混合:10μL组织粘合剂，285μLNaHCO 3和5μLNaOH。
    3. 将45μL所得溶液放在每个盖板上，并在室温下放置至少20分钟;该解决方案可以留在盖玻片上几个小时，但不能留下O / N。
    4. 将一个或两个35毫米4孔培养皿放在10厘米培养皿内，以产生两个防止污染的屏障。
    5. 制备含有98％Dulbecco's Modified Eagle's Medium的培养基（DMEM），1％N-2和1％氨苄青霉素（在微量离心管中每孔65μL）。使用前将溶液温热至25°C。

小鼠人工耳蜗解剖

  1. 斩首新生儿小鼠
    1. 获得一个60毫米塑料培养皿，并在其盖子上喷洒70％乙醇，使表面湿润。
    2. 将冷的HBSS从塑料实验室管倒入60毫米塑料的底部和50毫米透明的玻璃底培养皿中。将塑料实验室管和两个陪替氏培养皿存放在冰上，以便在不解剖时保持组织冷。
    3. 将P3-P5年龄的新生儿小鼠放在乳胶手套的切断手指上的冰上，并等到低温引起意识丧失（约1-3分钟）。
    4. 用操作剪刀快速拆卸鼠标，将身体处理在可密封的塑料袋中。将切断的新生儿头部放在70％乙醇在60毫米塑料培养皿的盖子上。
  2. 颞骨的宏观解剖
    1. 通过使用手术刀刀片从前端到后端（直接在矢状缝合线顶部）进行表面切割，去除头骨的皮肤。
    2. 用手术刀切割两个外耳道并将皮肤向前折叠以暴露整个头颅。
      注意:虽然此步骤通常不需要夹层显微镜，但可用于改进可视化。
    3. 使用＃15手术刀刀片沿着矢状缝线打开颅骨。确保通过从前到后轻轻地移动刀片来切割颅骨，以避免耳蜗的压缩。
      注意:颅骨在这个年龄时不应该僵硬，应该很容易切开。
    4. 使用＃15手术刀通过在轨道的正后方进行垂直切割，去除并丢弃鼻子刀。
      注意:头骨的后部应该还包含脑和耳蜗。
    5. 用＃4镊子通过钝性解剖处理前脑，小脑和脑干。
  3. 微观提取耳蜗
    1. 通过将镊子放在范围内并优化照明和聚焦，调整显微镜（6.5倍放大）和光源。
    2. 将颅骨的两半放入装有冷HBSS的60 mm塑料培养皿中。
    3. 完全暴露耳蜗/ e，可以识别为邻近周围的手腕动脉（颞骨内的曲折动脉），并使用＃4镊子将器官与颞骨平坦分离。
    4. 将耳蜗转移到50毫米，透明的，玻璃底的陪替氏培养皿中，并将盘定位在显微镜下。
    5. 将60毫米塑料培养皿与颅骨的另一半放在冰上。
    6. 从前庭系统中取出耳蜗，用＃4镊子仔细解剖耳蜗耳蜗胶囊（通常在此年龄为软骨）。使用＃55镊子进行所有进一步的步骤。
  4. 组织处理的最后步骤
    1. 通过使用微刀或两个镊子仔细分离粘附到Corti器官的螺旋韧带与耳蜗的其余部分和组织，继续处理内耳组织。
      1. 切入螺旋韧带和毛细胞区域之间的缝隙处的较暗，半透明的区域，并通过在最基础的方面抓住螺旋韧带并继续移除，并在顶端移动时轻轻地展开。
    2. 将样品放置以获得耳蜗的纵向矢状视图，并使用微型刀将耳蜗切成两至三个部分，将这些部分分类为顶端（中间）和basal转。去除组织上下不同于毛细胞和神经突的实际层，以便实现可以水平放置在培养皿上的耳蜗外植体片。
      注意:用于稳定粘附培养皿的适当尺寸大约是一个人工耳蜗的一半。
    3. 去除胸膜，一个非常薄的半透明层，立即高于Corti的器官，用镊子轻轻剥去。
    4. 通过用镊子触摸两侧的剥离器，将Reissner的膜立即脱离SGN，然后将其剥离。
      注意:用微型刀将其切割掉，以清除任何横向位置受损的毛细胞区域。

3.将标本转移到文化板上

  1. 从四个盖玻片中取出45μL的组织粘合剂溶液。用50μL无菌H 2 O清洗每个盖子，吸水。
  2. 拿起1毫升移液器。用大约120μL的DMEM将吸液管吸湿，以防止样品粘附在尖端内部。
  3. 使用1 mL移液管单独转移标本。从装有HBSS，小而透明的玻璃底的陪替氏培养皿中取出最多70μL，将样品与液体一起放在4孔培养皿中的4个镶嵌（用盖子盖子制成）之一上。
  4. 在显微镜下（50倍放大）检查样品处于正确的方向。确保去除胸膜的毛细胞面积向上。确保基底膜与修剪的基部部分面朝下并粘附在盖玻片上。
    1. 如果样品在检查时上下颠倒定位，则将残留在移液管尖端的HBSS沉积在嵌体中，并重新定位该片，直到其正确定向。
      没有TE:这样可以防止毛细胞漂浮在培养基中，而不需要盖玻片的结构支撑，这可能导致退化。
  5. 使用1 mL移液管吸出过量的HBSS。等待15秒。
  6. 将60μL制备的温育培养基（98％DMEM，1％N-2和1％氨苄青霉素）直接吸取到样品上。小心不要用吸液管接触标本。更换内外培养皿盖，并在37°C孵育O / N。
  7. 将所有储备溶液放回适当位置，处理屠体和残留废物，根据制度指导（ 例如使用乙醇或次氯酸盐）去除外科手术台，清洁并高压灭菌器具，并丢弃相应容器中的尖锐物。

4.添加最终文化媒体和兴趣物质

注意:耳蜗外植体将在10-16小时后使用。

  1. 准备一个mixtu重复使用97％DMEM，1％胎牛血清（FBS），1％N-2和1％氨苄青霉素（在微量离心管中每孔65μL;在使用前将溶液温热至25℃）。
  2. 在各个治疗组的溶液中加入感兴趣的其他物质。如果添加荧光物质（ 如绿色荧光蛋白（GFP））表达病毒;最近的出版物中，使用浓度为10 10 GC的腺相关病毒（AAV）48小时，50μL） 18 ，保护光。
  3. 将来自培养箱的含耳蜗外植体培养皿转移到层流罩下。
  4. 用吸液管从嵌体中吸出旧培养基（不含FBS）。
  5. 加入60μL/孔的制备的温育培养（处理）培养基（97％DMEM，1％FBS，1％N-2,1％氨苄青霉素和目标物质）。
  6. 将培养皿放回培养箱（37℃）。
  7. 查看r在显微镜下显微镜观察以识别污染，细胞迁移或耳蜗外植体脱落的迹象，并在最多7天后进行染色。

5.免疫荧光 - 第1天

  1. 制备封闭溶液（94％磷酸盐缓冲盐水（PBS），5％正常山羊或马血清（NGS / NHS，取决于第二抗体）和1％非离子表面活性剂（参见材料表 ））和储备抗体溶液（98.6％PBS，1％NHS和0.4％非离子表面活性剂与相应的抗体）。
    注意:抗体包括浓度为1:400+的兔抗Myo7A（肌球蛋白7A，内外毛细胞）和小鼠抗TuJ1 1:200+（β-微管蛋白，SGN）或小鼠（IgG1）抗体-CtBP2 1:200+（c-末端结合蛋白，用于突触前），小鼠（IgG2a）抗PSD95 1:50+（突触后密度，用于突触后）和鸡抗NF-H 1:1000+（神经丝，用于SGN和神经纤维）。 "+"means"或更高"。
  2. 用移液管吸出培养基。小心不要触摸标本。
  3. 在层流罩下，用无菌PBS冲洗耳蜗外植体两次，每次洗涤后将样品置于振荡器上5分钟。
  4. 在4％多聚甲醛（PFA - 注意）中将组织固定在摇床上（罩下）20分钟。吸取PFA。
  5. 将60μLPBS加入耳蜗外植体，将培养皿置于摇床上5分钟。吸出PBS。重复3次。
  6. 将耳蜗外植体置于制备的阻塞溶液（94％PBS，5％NHS和1％非离子表面活性剂）中30分钟。
  7. 将耳蜗外植体置于制备的储备抗体溶液（98.6％PBS，1％NHS和0.4％非离子表面活性剂）中，与RT相同的一抗（使用前漩涡）O / N。
    注意:用缠绕在塑料包装中的湿纸巾（或铝箔，如果添加的溶液）包裹陪替氏培养皿离子含有诸如GFP表达病毒的荧光材料）以保持培养皿的潮湿并防止溶液O / N的蒸发。

6.免疫荧光 - 第2天

  1. 制备4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色剂（300nM），并使用库存抗体溶液获得与步骤5.1中的一抗互补的正确的二抗混合物。 （ 例如 ，山羊抗兔488 1:200+和山羊抗小鼠568 1:200+或山羊抗小鼠（IgG1）568 1:1000+，山羊抗小鼠（IgG2a）488 1:500+，和山羊抗鸡647 1:200+或鬼笔环蛋白568 1:200+（用于内外毛细胞））。
  2. 吸出一抗溶液。
  3. 将60μLPBS加入耳蜗外植体，将培养皿置于摇床上5分钟。吸出PBS。重复3次。
  4. 将耳蜗外植体置于制备的储备抗体溶液（98.6％PBS，1％NHS和0.4％非离子表面活性剂）中，果实二次抗体（使用前旋涡）在柜台上1.5小时，防止光照。
  5. 吸出第二抗体溶液，并用DAPI染色剂（置于振荡器上1分钟然后抽吸）冲洗耳蜗外植体。
  6. 将60μLPBS加入耳蜗外植体，将培养皿置于摇床上5分钟。吸出PBS。重复3次。
  7. 使用镊子从4孔板中取出标本，将其浸入装有蒸馏水的接收器中，并垂直使其与纸巾接触，干燥盖玻片。
  8. 将一滴抗衰老的安装介质放在显微镜载玻片上并倒置盖玻片，将向下的组织浸入介质中。
  9. 使用透明的指甲油密封盖玻片，周向覆盖边缘（不在玻璃下破碎样品）。将幻灯片平放放置在远离光线的覆盖区域15 - 20分钟，直到干燥将它们放在盒子中或在共焦显微镜下检查。
    注意:通过将载玻片存放在4或-20°C下，荧光染色最好保存。

共焦成像

  1. 获取Corti地区器官的概览和放大图片，包括神经突和神经元。
    注意:成像过程的标准设置:1,024 x 1,024像素的格式，速度为400 Hz，帧平均为3,20％的整体激光强度，通常为20X和63X透镜（含有2X数码变焦）。 DAPI，Myo7A和TuJ1染色方案的通道设置如下:405 5％DAPI"Smart Gain"766.8V"Smart Offset"0.0％ - 488 15％异硫氰酸荧光素（FITC），"Smart Gain"622.2V ，"智能偏移"0.0％ - 561 13％四异氰酸异硫氰酸四甲酯（TRITC），"智能增益"562.4V，"智能偏移"0.0％。
  2. 使用z-stack合并图像软件获得z轴投影。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

虽然许多协议集中在Corti外植体的器官，但是这种技术试图保留包括SGN在内的整个耳蜗转向的解剖学。这使得研究人员有机会分析给药治疗对神经突和神经元的体细胞除了科尔蒂的器官之外。如本文所述，进行保留部分梗阻的解剖在技术上更具挑战性，而不是仅仅去除皮质的器官。然而，神经突和SGN区域是重要的，因为在应用前庭神经鞘瘤分泌物（ 图1 ）和细...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

在进行耳蜗外植体实验之前，研究人员必须完善解剖技术。毛细胞通常在学习曲线早期进行的解剖过程中被破坏，并且其完整性的一个特别有问题的时刻是去除胸膜，这需要稳定的手，适当的工具和经验。为了节省时间和资源，应在夹层显微镜下进行视觉控制，并注意潜在的损伤区域。代替使用昂贵的一级和二级抗体，更便宜的试剂如鬼笔环肽更适用于初步实验。在某些实验（分析未受影响的部?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者没有什么可以披露的。

致谢

这项工作得到了国家失聪和其他传播障碍研究所资助的R01DC015824（KMS）和T32DC00038（支持SD），国防部授予W81XWH-15-1-0472（KMS），贝塔雷利基金会（KMS）， Nancy Sayles Day基金会（KMS）和Lauer耳鸣研究中心（KMS）。感谢Jessica E. Sagers，BA对稿件的深刻见解。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin, Sodium SaltInvitrogen11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)BD Transduction Laboratories612044
anti-Myo7A antibody, rabbitProteus Biosciences25-6790
anti-NF-H antibody, chickenEMD MilliporeAB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)Antibodies Inc.75-028
anti-TuJ1 antibody, mouseBioLegend801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mgCorning354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner ringsGreiner Bio-One627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One227261
Clear Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mmTed Pella Inc.260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
Distilled water, 500 mLThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 ForcepsFine Science Tools11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5%Sigma-Aldrich459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificR37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mLEMD MilliporeTMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mLThermo Fisher Scientific14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless SteelMountainside MedicalTechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30°Fine Science Tools10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72VWR16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mLThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mLThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 LThermo Fisher ScientificSS266-1
Normal Horse Serum (NHS)Invitrogen16050130
Operating scissorsRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, CrystallineSigma-AldrichP6148Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023 Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher ScientificA12380
Prep Pad, Non Sterile Medline05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mLEppendorf022363719Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mLEppendorf022363204Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15Fine Science Tools10015-00
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools10004-13
Stemi 2000-C Stereo MicroscopeZeiss 000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscopeLeicaN/A
Triton-X (non-ionic surfactant)IntegraT756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescenceVector Laboratories, Inc.H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thickZipline0609132541599

参考文献

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432(2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260(2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101(2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。