果蝇岛试验中运动行为的高通量分析

摘要

海岛试验是一种比较新的, cost-effective 的方法, 可用于评估的基本运动行为的果蝇。这份手稿描述了自动数据处理的算法和岛屿试验数据的客观量化, 使得这种方法成为一个敏感的高通量的大基因或药理屏幕的读数。

摘要

下一代测序技术的进展有助于识别 (候选) 疾病基因的运动障碍和其他神经系统疾病以越来越快的速度。然而, 对于这些疾病的分子机制, 却知之甚少。果蝇的遗传、分子和行为工具箱使这种模型生物体特别有用, 以高通量的方式表征新的疾病基因和机制。然而, 高通量的屏幕需要有效和可靠的化验, 理想情况下, 是 cost-effective, 并允许自动化量化的特点与这些疾病有关。海岛试验是一种 cost-effective 和容易地设置方法评估果蝇运动行为。在这个试验中, 苍蝇被抛到一个固定高度的平台上。这就产生了一种固有的马达反应, 使苍蝇能够在几秒钟内从平台上逃生。目前, 对拍摄的岛屿化验进行定量分析是手工进行的, 这是一项费力的工作, 特别是在执行大屏幕时。

这份手稿描述了 "果蝇岛检测" 和 "岛屿分析" 算法的高通量, 自动化数据处理和量化的岛屿化验数据。在安装过程中, 连接到膝上型计算机的简单摄像头在执行检测时收集平台的图像系列。为开源软件开发的 "果蝇岛试验" 算法斐济处理这些图像系列和量化, 为每个实验条件, 在平台上的苍蝇数量随着时间的推移。"海岛分析" 剧本, 与自由软件 R 兼容, 被开发了自动地处理获取的数据和计算治疗或基因型是否统计地不同。这极大地提高了岛上试验的效率, 使其成为基本运动和飞行行为的有力的读数。因此, 它可以应用于大屏幕调查飞行活动能力,果蝇模型的运动障碍, 和药物的功效。

引言

近年来, 下一代测序技术的进展, 极大地促进了对大脑退行性运动障碍 (例如,小脑共济失调和帕金森) 的基因的识别, 这是外周神经元起源 (例如,肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫) 和肌肉来源 (如,杜氏肌营养不良症和强直营养不良)¹²³⁴.尽管如此, 对于大多数这些疾病的分子机制, 人们还是知之甚少。更好地了解这些机制对于发展治疗是必不可少的。

与人类一样, 模型生物体的运动, 如在果蝇中的飞行和移动, 是由中央大脑、周围神经系统和肌肉控制的。此外, 快速的世代时间和遗传工具箱的果蝇使这个模型有机体特别适合高通量筛选的基因涉及运动障碍和药物测试^5,6.由于大量的条件需要在这样的屏幕上测试, 可靠, cost-effective, 和相对简单的化验, 以及工具, 以自动的方式量化输出结果, 是非常可取的。

施密特et al.(2012)⁷描述了一个名为 "岛屿检测" 的低成本测试, 以评估果蝇的运动行为。该岛的检测已成功地用于 large-scale 筛查, 以确定具有胶质细胞特异功能的基因⁷, 在评估果蝇模型的智力残疾⁸, 并为一般评价飞行马达行为⁹。该岛试验的原理设计包括一个高架平台上, 其中几个苍蝇抛出。这导致了一种先天的运动行为, 使健康的苍蝇能够在几秒钟内从平台上逃脱。该检测方法测量在平台上剩余的苍蝇数量^7,8,9。所有这些特征表明, 海岛检测可能是一个强有力的筛选工具的基因参与运动障碍。

目前, 对拍摄的岛试验数据进行定量分析的方法是手动^7,8,9。为了提高检测的效率, 开发了一种低成本的半自动定量的方法。安装使用一个简单的摄像头连接到一台笔记本电脑收集的图像时间序列的平台, 与帧获得每0.1 秒. 然后用 "果蝇岛检测" 宏来处理平台上的苍蝇数量时间."果蝇岛检测" 宏分为三独立 sub-macros: (I) "创建堆栈和投影", sub-macro 标识不同子文件夹中存储的各种岛实验, 并创建一个堆栈和每个时间序列。(二) "定义平台" sub-macro 将连续打开位于单个实验子文件夹中的所有 "Projection_image_name. tif" 文件, 此时用户被要求手动将岛平台定义为感兴趣的区域 (ROI)。(三) "分析" 在时间序列中自动量化在平台上剩余的苍蝇数量。sub-macros 可以连续运行 (在一个运行) 或独立。对于统计数据分析, 编写了一个脚本来自动处理所获得的数据, 并应用统计测试来确定治疗/基因型的行为是否有明显的不同 (图 1)。最后, 证明了这种设置可以用来评估和量化的异常运动能力的果蝇模型的共济失调-扩张 (AT)。

研究方案

1. 岛屿试验箱的构造

1. 准备一个由结实的材料制成的托盘, 如聚甲基丙烯酸甲酯和 #160;(P mma), 以包含一层水 ( 即 和 #160; 洗澡)。确保材料不是白色的.
   注意: 建议使用 40 x 35 x 2.5 cm ³ 的尺寸 ( 图 1A )。
2. 准备一个盒 (42 x 38 x 25 cm ³ ) 制成的一个坚固的, 透明的材料, 如 PMMA, 被放置在浴缸周围, 以防止苍蝇逃逸到实验室空间。在侧面放置一个孔 (20 x 30 cm ² ), 以便实验者能够轻松地处理带苍蝇的小瓶并将它们放在岛上 ( 图 1A ).
3. 准备一个高架平台 10 x 15 x 2.5 cm ³ 在维度中, 由不透水的材料 (PMMA 或塑料) 制成.
   注意: 这个平台需要有一个统一的白色表面, 以确保良好的对比度图像分析。大小不一定是固定的, 但它应该足够大, 以确保所有的苍蝇最初降落在平台上, 并获得机会走在它 ( 图 1A ).
4. 通过将平台粘附到浴缸中或在平台盒内放置重物或其他重物来固定该台, 以防止平台在实验/拍摄过程中的位置变化.

2。软件要求和安装

1. 安装图像录制软件。
   1. 下载图像录制软件以记录岛屿图像系列 (请参阅 材料表 ) 并在计算机上安装该软件.
      注: 本协议中描述的影像录制软件仅受 Windows 支持。已将其他用户的替代项添加到 材料表 中.
2. 和 #34; 果蝇 岛试验和 #34; 宏安装.
   1. 从以下网站下载 和 #34;D rosophila 岛检测和 #34; 宏和兼容的斐济 ¹⁰ 版本 (1.4 或更高): https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
   2. 将光标移至 #34; 岛检测和 #34; 目录并单击并 #34; 查看. #34;
   3. 单击 #34;D ownload 所有. #34; #160; 文件夹内容将作为. zip 文件下载; 解压下载的文件.
   4. 复制和 #34; 果蝇 海岛化验. ijm 和 #34; 文件进入和 #34; 斐济. 应用程序/插件/目录. #34;
      注意: 当启动斐济时, #34;D rosophila 岛检测和 #34; 宏将出现在插件下拉菜单的底部.
3. 和 #34; 海岛化验分析和 #34; 脚本安装和下载.
   1. 从以下网站下载 R ¹¹ : https://cran.rstudio.com。将其安装在计算机上.
   2. 从以下网站下载 R 工作室: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/。将其安装在计算机上.
      注: #34; 岛屿测试分析和 #34; 脚本只能在 R 上运行。r 工作室, 其更容易的用户界面, 被提出作为替代步骤的用户没有经验的 r.
   3. 下载和 #34; 海岛化验分析和 #34; #34 的脚本; 果蝇 海岛化验和 #34; 目录在以下网站: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      注意: 在执行步骤2.2 后, #34; 海岛化验分析和 #34; 脚本也可以在被解压的文件夹中找到, 称为和 #34; 岛屿检测. #34;

3。在海岛试验中要测试的苍蝇的制备

1. 为每个实验条件收集分步飞行 (CO ₂ ) 麻醉, 如前所述 ¹³ (在一段1-2 天).
   1. 每个实验条件下至少准备3样品瓶, 每一个都包含大约15分阶段的苍蝇。只使用完整的翅膀和相同的年龄和性别的苍蝇.
      注: 对于这里所描述的实验, 5 样本小瓶含有15雄蝇的基因型 w ^-;Actin-Gal4/+ (控件) 和 w ^-;Actin-Gal4/GD11950 (tefu rna 干扰) 是收集在羽化的一天, 年龄为4天, 并用于执行海岛化验。rna 干扰、控制菌株和 Actin-gal4 驱动程序是从一个商业来源获得的 (请参见 材料表 ).
2. 让苍蝇恢复以避免麻醉剂的影响 (至少1天使用 CO ₂ ), 然后再测试在岛上收集的苍蝇在感兴趣的年龄.

4. 实验设置

注意: 请参见 图 1B 。

1. 在浴缸中添加少量肥皂的冷水, 并将平台放置在中间.
   注: 肥皂减少水的表面张力;碰水的苍蝇就会淹死。这样可以防止在实验过程中飞行的苍蝇数量增加.
2. 将透明框放在托盘顶部, 并使用灯从上方照亮平台.
   注意: 该平台的照明主要是为了确保适当的视频对比。一个普通的 12 V LED 灯是合适的.
3. 将摄像头直接置于平台上方 (在框外) 并将其连接到计算机.
4. 在计算机上创建新的文件夹, 以便在实验之前存储不同的实验数据.
   1. 遵循 图 2A 中说明的示例结构来创建文件夹。例如, 如果实验设计需要测试两个具有五复制的基因型, 首先创建一个包含实验日期的主文件夹。在主文件夹内, 创建两个子文件夹 (每一个基因型)。在基因型文件夹内, 创建五新的子文件夹, 每个复制一个.
      注: 为了进一步分析, 必须将对应于单个实验的图像序列保存在具有唯一名称的文件夹中.

5。在和 #34 中安装视频设置; 捕获设备和 #34; 接口部分

1. 打开图像录制软件, 并在 "和 #34" 下进行捕获和 #34; 选项卡上, 单击 #34; 时间推移图像和 #8230; #34; 并选择合适的摄像头作为和 #34;捕获设备. 和 #34;
2. 将一只死苍蝇放在岛上; 通过单击 #34, 调整视频设置; 视频设置和 #34; 框。在工具栏中滚动, 调整亮度、对比度和颜色, 使死苍蝇在白色背景上出现黑色 ( 图 2B )。当调整完成后, 单击并 #34; 确定. #34;

6。录制和视频保存设置在和 #34; 时间推移和 #34; 接口部分

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调整 #34 中的设置; 时间推移电影设置和 #34; 将实验保存为. avi 文件。点击 #34; 浏览和 #8230; #34; 选择要存储影片的目录, 定义视频的名称, 然后按和 #34; 保存. #34;
注意: 视频文件不用于数据的量化; 但是, 它可能是有用的, 得到一个整体的想法关于实验.

调整 #34 中的设置; 时间推移电影设置和 #34; 部分.

1. 在 "压缩" 框中, 选择和 #34; 英特尔 IYUV 代码和 #34; 用于视频压缩和选择和 #34; 每隔0.1 秒一帧, #34; 与 #34;P 回退率 (图像每秒): 和 #34; 在 10.
2. 通过单击和 #34 将实验时间序列保存为. bmp 帧; 高级和 #8230; #34; 选择和 #34; 为每个捕获的帧创建一个. bmp 图像. #34; 单击 #34; 浏览. #34; 选择同一个目录 #34 期间 AVI 电影捕捉和;D; 窗口 (如在步骤6.1 中选择), 单击并 #34; 打开、#34; 然后按下 #34; #34; 注意: 在实验过程中, 帧被存储为. bmp 文件 (数据分析所需)。程序将帧命名为和 #34; A 和 #34; 后跟与帧捕获序列相对应的数字 ( 例如, 和 #34; A_number. bmp 和 #34;) ( 图 2C )。始终将属于不同实验的图像保存在新文件夹中, 以确保以前录制的图像系列不会被覆盖。请注意, 图像不会自动保存在与视频文件相同的文件夹中, 除非在 "#34" 下选择此文件夹; 浏览和 #8230; #34; 单击 #34; 高级和 #34; 框.

7。岛屿分析和数据收集

1. 在图像录制软件的延时图像界面中按 start 按钮开始录制.
2. 点击包含苍蝇的实验小瓶 (步骤 3) 2-3 次, 以确保苍蝇在瓶子的底部。快速移除小瓶的插头, 并大力移动, 在平台上轻敲瓶子, 使所有苍蝇同时落在平台上 ( 图 1C ).
3. 在大约三十年代之后, 按 #34; 停止和 #34; 按钮停止录制.
   注意: 如果所有的苍蝇都从平台上消失, 记录可以提前停止.
4. 在停止图像录制后, 手动将三十年代保留在平台上的苍蝇移除.
5. 在继续录制下一个实验之前, 请更改. bmp 文件和影片的目标目录 (参见6节).

8。数据处理: 运行和 #34; 果蝇 岛测定和 #34; 宏

注意: 请参见 图 1D 。

1. 运行和 #34; 创建堆栈和投影/#34; sub-macro I 生成收集的图像系列的堆栈和投影.
   1. 启动斐济, 单击 #34;P lugins 和 #34; 在工具栏中, 选择和 #34; 果蝇 岛检测和 #34; 在下拉菜单中, 将出现一个新窗口.
   2. 输入和 #34; 第一个图像时间序列标识符和 #34; 在宏图形界面中设置
      注: 记录的图像帧被保存为和 #34; 数字. bmp 和 #34; 根据图像的获取顺序。在和 #34; 第一帧标识符和 #34; 宏接口, 用程序和文件扩展名给定的第一帧的数字填充设置。填充和 #34; 第一帧标识符和 #34; 与 #34;-0001.bmp, #34; 自第一帧被称为和 #34; 0001. bmp 和 #34; ( 图 2C )。如果其他图像格式 (如. tiff 或. jpeg) 是由网络摄像头软件生成的, 请指定第一个映像的正确文件扩展名和 #34; 第一个图像时间序列标识符. #34;
   3. 只选择 #34; 创建堆栈和投影 #34;sub-macro, 点击和 #34; 好的, #34; 选择包含所有子文件夹的主目录, 并进行单独的岛屿化验试验.
      注意: 包含 #34 的每个单独实验文件夹中的. bmp 文件; 第一帧标识符和 #34; 随后将被处理。两个新文件将出现在每个单独的实验子文件夹中, 默认为 #34; Stack_image_name 和 #34; #34;P rojection_image_name. tif 和 #34; ( 图 1D )。执行此步骤后, 即可删除. bmp 文件。堆栈和投影. tif 文件包含所有数据, 足以进行进一步分析.
2. 运行和 #34;D efine 平台和 #34; sub-macro II 选择平台的确切位置.
   1. 打开和 #34 的图形界面; 果蝇 岛试验和 #34; 仅选择 #34;D efine 平台和 #34; 复选框, 然后按下 #34; #34; #34; 选择目录和 #34; 窗口中, 选择主目录实验的子文件夹存储和 #34; 选择. 和 #34;
      注意: #34;D efine 平台和 #34; sub-macro 自动搜索和 #34;P rojection_image_name. tif 和 #34; 在主目录中存储的所有子文件夹中的文件。#34;P rojection_image_name. tif 和 #34; 存储在第一个文件夹中的图像, 以及两个窗口和 #8212; #34;D efine 平台和 #34; 和 #34; ROI 管理器和 #34; #8212; 将打开.
   2. 选择和 #34;P olygon 选项和 #34; 工具栏中用于绘制与岛平台相匹配的选项.
      注意: 从选择中排除平台的边界是非常重要的。请参见 图 2D .
   3. 在第一个图像中选择平台后, 单击 #34; 添加和 #34; 在和 #34; roi 管理器和 #34; 窗口; 选定区域将作为一组值出现在 roi 管理器窗口中 ( 图 2D )。新闻和 #34; #34; #34;D efine 平台和 #34; 窗口。该宏将继续进行下一个投影.
   4. 单击存储在 #34 中的数字 ( 图 2D ); ROI 管理器和 #34; 窗口; 以前的选择将自动显示在当前图像投影中.
      注: 由于该岛平台可能具有相同的大小和位置, 当实验是连续执行 (只要摄像头和岛屿的位置保持不变), 这是有用的存储 roi 定义的平台, 在和 #34; roi 管理器. #34;这样做, 用户将节省时间;在即将到来的预测中, 只需要单击 "ROI 管理器" 中临时存储的选择.
   5. 如果与上一个实验相比, 该岛的位置略有移动, 请通过 left-clicking 在选区中心调整选区位置, 并将所选区域拖动到所需位置.
   6. 如果所选内容与平台不匹配, 则 left-click 选择外部, 并使用 #34;P olygon 选择和 #34 为平台描绘新的选择; 工具。通过单击和 #34 将新选择存储在 roi 管理器中; 添加; #34; 新的选择将出现在和 #34; ROI 管理器和 #34; 可连续使用的窗口.
   7. 调整选定内容后, 单击 "#34"; #34; #34;D efine 平台和 #34; 窗口并重复该过程, 直到定义了所有平台.
      注意: 请注意, 该平台的二进制图像与在黑色背景、命名和 #34;P latform_image_name 中所划定的 ROI 区域相对应. tif 和 #34; 在同一实验子文件夹中出现的堆栈和投影的每个处理图像在步骤 8.1.3 ( 图 1D ) 中生成的图像.
3. 定义最小飞行大小.
   注意: 此设置定义最小飞行大小 (以像素为单位)。小于指定最小尺寸的粒子将被排除在分析之外, 以避免因噪音而产生误报。
   1. 打开由和 #34 创建的图像堆栈; 创建堆栈和投影 #34; sub-macro i.
   2. 通过单击图像和 #62; #62; 类型和 #62; #62; 8 位, 将图像堆栈转换为8位.
   3. 转到菜单, 按图像和 #62; #62; 调整和 #62; #62; 阈值, 确定 #34;D 柜的背景和 #34; 按下 #34; 应用; #34; 第二个窗口称为 #34; 阈值和 #34; 将出现。点击 #34;D 方舟 backgro#34; 新闻和 #34; 好的. #34;
      注意: 将创建一个二进制图像堆栈, 其中的苍蝇是用黑色定义的, 而平台是白色的。如果不是这样, 则应用 #34; 反转和 #34; 通过单击编辑和 #62; #62; 反转和 #62; #62; 运行.
   4. 通过单击 "分析和 #62; #62 设置缩放比例来检测像素数。应用下列设置: 像素距离 = 1, 已知距离 = 1, 像素长宽比 = 1, 长度单位 = 像素。新闻和 #34; #34;
   5. 在工具栏中选择 "和" #34; 魔杖和 #34; (跟踪) 工具, 然后单击平台上的苍蝇 (黑点)。按 ctrl + m (Windows 用户) 或 cmd + m (Mac 用户);新的 #34; 结果和 #34; 窗口将以像素为单位指示所选点的区域。连续进行数只苍蝇, 并确定最小飞行大小.
      注意: 在运行宏时, 设置和 #34; 最小飞行大小和 #34; 设置为最小的观察飞大小减去10% 的边距。( 图 2E ).
4. 运行和 #34; 分析和 #34; sub-macro III 以量化从平台中逃逸的苍蝇.
   1. 转到工具栏, 选择和 #34;P lugins、#34; 并选择了 #34; 果蝇 岛检测. #34;
   2. 调整和 #34; 最小飞行大小和 #34; 根据步骤8.3 中定义的值设置.
      注意: 仅当 #160 的标准设置、#34、最小飞行大小和 #34、原因和 #160、排除在平台上存在的苍蝇或 #160 时, 才使用步骤8.3 中定义的值; 宏将背景信号检测为苍蝇.
   3. 在和 #34 中; 每瓶和 #34 的苍蝇数; 设置, 在完整的实验中, 填充瓶子中的最大数量的苍蝇。例如, 如果一个实验含有15只苍蝇的小瓶, 另一些含有20只苍蝇, 另一些含有23只苍蝇, #34; 每瓶和 #34 的苍蝇数; 必须表示为 23.
   4. 选择 #34; 分析和 #34; 复选框并按下 #34; #34; 新的 #34; 选择目录和 #34; 窗口将出现。选择主目录 (包含所有子文件夹和文件), 然后按和 #34; 选择. #34;
      注意: 宏将分析所有存储在子文件夹中的图像, 只要它们含有和 #34; stack_image_name、#34; #34;P rojection_image_name 和 #34;#34;P latform_image_name #34 文件。宏将处理图像后的图像。宏输出由一个名为和 #8220 的二进制结果图像堆栈组成; result_stack_subfolder_name. tif 和 #8221; 一个结果文本文件, 称为和 #34; result_subfolder_name; 在每个数据文件夹中出现. #160; 生成的文本文件 (.txt) 包含与图像堆栈相对应的定量测量, 由9列组成。这些列的内容在 表 1 中进行了总结。#34; Result_stack_subfolder_name. tif 和 #34; 对应于一个实验的图像时间序列, 在实验过程中检测到的苍蝇以白色背景上的黑点 ( 图 1E ) 表示.
   5. 仔细检查结果堆栈以确保没有发生任何工件, 并且宏的工作正确无误 ( 图 2F ).
      注意: 工件的例子可以是不是苍蝇的图像元素, 而是通过图像分割算法 (误报) 检测到的。例如, 这可能是由于对 ROI 的选择不准确而导致的背景信号检测.

9。数据分析使用和 #34; 海岛化验分析和 #34;

1. 根据 图 2A 结构显示数据, 以便与 #34 进行分析; 岛分析和 #34; 脚本。生成带有子文件夹的主目录, 其中每个子文件夹对应一个要分析的实验条件.
2. 在子文件夹中, 生成包含独立实验复制的文件夹 ( 图 2A ) 以及由和 #34 生成的 results.txt 文件; 果蝇 岛试验和 #34; 宏.
   注: #34; 海岛化验分析与 #34; 宏将同时处理位于主目录中的所有实验条件.
3. 启动 r 或 r 工作室。单击文件和 #62; #62; 打开文件和 #8230; 在工具栏中选择和 #34; 海岛化验分析和 #34; 脚本.
   1. 在运行和 #34 时安装 ggplot2 和 matrixStats 包; 海岛化验分析和 #34; 第一次编写脚本。在控制台窗口中键入以下内容:
      和 #62; 安装. 软件包 (#34; ggplot2 和 #34;), 输入
      和 #62; 安装. 包 (& #34; matrixStats 和 #34;), 请输入
4. 指定脚本中数据和分析输出文件的位置。在下面的脚本行中插入:
   1. 行 16: 插入包含要分析和比较的实验的主目录的路径 (在 图 2A 中, 这是指向和 #34 的路径; 海岛化验与 #34;文件夹).
   2. 行 19: 插入存储分析输出文件的文件夹的路径.
      注意:16 行中所示的目录只能包含要分析的文件夹。如果在16行和19行中插入的路径相同, 则脚本也将无法正常工作.
5. 通过单击代码和 #62 运行脚本; #62; 运行区域和 #62; #62; 从工具栏运行 "所有"
   注意: 请注意, 三产生的. csv 文件和一个生成的 .txt 文件 ( 图 1E ) 出现在19行定义的目录中。这些是: (I) #34;d ata_all_conditions. csv 和 #34; 文件包含与每个实验条件和实验复制相对应的处理数据, 如 表 2 中所述组织。(二) #34; 统计摘要. csv 和 #34; 文件概述了每个实验条件下, 平台上苍蝇百分比平均值、标准差 (SD) 和标准误差 (SEM)。(三) #34; 联合自卫队 csv 和 #34; 文件包含每个实验复制的曲线下的区域。(IV) 视乎主文件夹内的条件数目而定, 该脚本将导出 a 和 #34; Welch_t-test_results. txt 和 #34; 文件 (2 条件) 或 #34; AUC_anova_results #34; 文件 (超过2条件), 其中 t 测试结果或对实验条件下的曲线面积进行了方差分析。注意, 四不同类型的. tiff 图像文件 ( 图 1E ) 显示在19行中定义的路径中。这些被称为: 和 #34; Name_Of_Data_Folder. tiff 和 #34; (其中 Name_Of_Data_Folder 表示用户给出的文件夹名), 和 #34; #34; #34; Escape_response_all_conditions. tiff, #34; 和 #34; AUC_anova. tiff. #34; 详细信息关于这些图的内容, 可以在该手稿的代表性结果和 图 3 中找到.

结果

在所描述的协议中,果蝇岛分析数据是通过三步骤获取和处理的。首先, 在岛平台上抛出的果蝇的逃跑响应被记录在一个摄像头上, 并作为个人. bmp 图像 (协议节 1-7)。其次, "果蝇岛检测" 宏 (步骤 8) 处理帧, 生成 "result.txt" 文本文件(表 1), 其中对每个帧中检测到的对象数进行汇总, 并显示一个图像堆栈 "Result_stack. tiff", 这表明在每个框架的平台区域内检测到的对象。第三, "岛屿化验分析" 脚本 (协议9节) 处理存储在 "results.txt" 文件中的单个实验的宏数据。脚本中包含了几个步骤来筛选和合并数据以进行统计分析。在平台上抛出苍蝇的第一帧被检测到并被认为是时间点1。早期的帧从数据集中被删除。100帧跟随时间点 1 (对应于十年代) 被选择为分析。实验中, 在平台上检测到的初始数量小于5的苍蝇被自动排除在分析之外, 从而消除了不可靠的实验结果。试验中, 在平台上检测到的苍蝇的初始数量超过了 "每瓶苍蝇数" 的设置加上3的耐受性。这消除了噪声粒子被错误地检测为苍蝇的数据集。然后, 该脚本将计算每个时间点检测到的苍蝇的百分比, 与该系列中检测到的最高数量的苍蝇相比。由苍蝇进出 ROI 引起的数据集中的错误 (随着时间的推移被检测为减少, 然后在平台上飞行的百分比增加) 会自动更正为在平台上始终存在的早期阶段.在主目录中存在的特定实验条件的所有复制数据集都被合并并导出到 "data_all_conditions. csv" 文件中。它的列表示表 2中描述的变量。该脚本还将导出每个实验条件的折线图, 根据包含数据的文件夹命名。此图显示了在相应的文件夹(图 3A-b)中存在的试验性复制在平台上剩余的飞行百分比 (逃跑响应)。在 "统计摘要. csv" 文件中计算并总结了每个实验条件的平均值、SD 和 SEM。一个名为 "Escape_response_all_conditions. tiff" 的折线图显示了在主文件夹(图 3C)中存在多达12实验条件的平均飞行逃生响应。最后, 在 "联合自卫队. csv" 文件中计算并总结了在主文件夹中存在的所有实验条件下曲线的面积。根据主文件夹中存在的条件数, 脚本要么执行两尾不配对的韦尔奇 t 检验 (2 条件), 要么进行多项测试的 Tukey 校正 (超过2条件), 以确定是否实验条件不同。这些结果在 "Welch_t-test_results. txt" 或 "AUC_anova_results" 中总结。在执行方差分析时, 该脚本还将导出 "AUC_anova. tiff" 文件, 以显示平均联合自卫队的差异和所比较的实验条件的95% 置信区间。所有实验条件下, 实验复制曲线下绝对区域的值显示为 "中线" (图 3D) 中的单个数据点。

共济失调扩张 (AT) 是一种常染色体隐性运动障碍的特点是早期发作小脑共济失调由于突变的共济失调扩张突变 (ATM) 基因¹⁴。ATM的果蝇orthologue 的变种, tefu, 显示移动性和长寿性缺陷¹⁵。为了评估 "果蝇岛检测" 宏, 在岛试验中测试了一个果蝇模型, 并将宏的数据输出与手动数据计数进行了比较。结果表明, 无处不在的tefu击倒 (w ^-;Actin-Gal4/GD11950) 与它们的遗传背景控件相比, 大大降低了这些苍蝇离开平台的能力 (w ^-;Actin-Gal4/+) (图 4).1秒后, 50% 的控制苍蝇逃脱了平台, 相比之下, #60; 1% 的tefu-rna 干扰飞。重要的是, 用宏获得的数据忠实地再现了通过手工计数获得的数据, 表明该宏是一种可靠的工具, 可用于定量分析岛屿化验数据和评估移动缺陷(图 4A-b)。

图 1: 流程图概述了岛屿试验的要求、试验过程和分析.(A) 海岛化验设备。(B) 试验性设置为海岛化验。(C) 海岛化验。(D) 使用 "果蝇岛检测" 宏处理海岛化验数据。"果蝇岛检测" 宏由 3 sub-macros: 1) 进行叠加和投影, 2) 定义平台和 3) 分析。(E) 使用 "岛屿化验分析" 脚本对数据进行处理和统计评估。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 在协议中需要进行不同调整的示例.(A) 所需的目录结构, 其中必须为数据处理和分析而存储岛屿化验实验。(B) 在调整视频设置时, 白色背景上的苍蝇必须呈黑色。(C) 图像帧输出文件由本手稿中描述的图像记录软件保存。(D) 黄色轮廓显示平台选择。"ROI 管理器" 中的存储平台选择以蓝色突出显示。(E) 在调整 "最小飞行大小" 设置期间, 苍蝇被表示为白色圆点。结果窗口以像素为单位显示苍蝇的面积。(F) 示例中的单个记录的图像帧 (在左侧) 和相应的帧在生成的图像堆栈中, 获得与 "果蝇岛检测" 宏 (在右边)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 通过 "岛分析" 脚本进行数据处理后获得的结果图像.(A) 折线图, 显示每个控制实验复制的逃跑响应。(B) 折线图显示每个 tefu 的 rna 干扰实验复制的逃跑响应。(C) 所示实验条件的平均飞行逃逸响应;误差线代表 SEM. (D) 点图表示控制和突变条件下的曲线分布区域。tefu rna 干扰和控制条件的实验复制显示为单独的数据点 (黑色) 与中线 (红线)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 无处不在的tefu击倒苍蝇显示出离开平台的能力明显下降。数据表示平台上的飞行百分比 (以时间为控制) (w^-;Actin-Gal4/+) 和 tefu rna 干扰 (w^-;Actin-Gal4/GD11950) 苍蝇。(复制次数 = 5; 误差线表示 SEM)。(A) 通过 "果蝇岛检测" 宏获得的原始数据。(B) 点图表示在 "果蝇岛检测" 宏 (韦尔奇不成对 t 检验, ** 和 #60 0.01) 中获得的控制和 tefu 干扰条件下的曲线分布区域。(C) 通过手动计算每秒岛上存在的苍蝇数量获得的原始数据。(D) 点图代表在曲线分布下的区域控制和 Tefu 的干扰条件, 由手工计数 (韦尔奇不成对 t 检验, ** 和 #60; 0.01)。误差线代表 SEM.请单击此处查看此图的较大版本.

列名	描述
切片	帧名称。
数	在平台范围内检测到的对象数 (ROI)。
总面积	在平台 (ROI) 范围内的框架中检测到的对象的总面积 (以像素为单位)。
平均尺寸	在框架中检测到的对象的总面积除以平台范围内的对象数 (ROI)。
% 区域	相对于平台总面积 (ROI) 的对象所占面积的百分比。
Perim	在平台 (ROI) 范围内的框架中检测到的对象的总周长 (以像素为单位)。
最小飞码	用户在 "果蝇岛检测" 宏的图形界面中定义的最小飞行大小设置 (以像素为单位)。
区域 ROI	用户在运行 sub-macro 定义平台 (以像素为单位) 期间定义的平台区域 (ROI)。
苍蝇数量	用户在 "果蝇岛检测" 宏的图形界面中定义的每个实验使用的苍蝇数量。

表 1: 由 "果蝇岛检测" 宏测量的参数。运行 "果蝇岛检测" 宏时, 此表中描述的参数将出现在 "results.txt" 文件中。

列名	描述
切片	帧数。
数	在平台范围内检测到的苍蝇数量 (ROI)。
十. 区域	在平台 (ROI) 范围内的帧中检测到的苍蝇的总面积 (以像素为单位)。
最小飞码	用户在 "果蝇岛检测" 宏 (以像素为单位) 的图形界面中定义的最小飞行大小条目设置。
区域 ROI	用户在运行 sub-macro "定义平台" 时定义的平台区域 (ROI, 以像素为单位)。
苍蝇数量	用户在 "果蝇岛检测" 宏的图形界面中定义的每个实验使用的苍蝇数量。
十. 计数	在试验台上, 相对于平台上检测到的最高数量的苍蝇, 在平台上存在的苍蝇的百分比。
Timepoint	时间点1表示要分析的第一帧, 对应于在平台上首次出现苍蝇的帧。在使用所描述的设置时, 每个复制分析都有100帧 (对应于十年代。
实验	每个条件的复制数。
条件	指示实验条件的名称 (根据包含数据的文件夹的用户定义名称)。

表 2: 使用 "岛分析" 脚本处理数据后所获得的变量的描述.该表中描述的参数显示在 "data_all_conditions. csv" 文件中, 处理数据时使用 "岛分析" 脚本。

讨论

该协议描述了 "果蝇岛检测" 宏, 它定量地评估了在岛试验期间的果蝇马达行为。该宏精确地计算了平台上的苍蝇, 使得该岛检测高度敏感, 适合于定量高通量的运动缺陷评估。该方法可以比较任何条件, 苍蝇生长在不同的遗传和/或环境条件, 包括药物接触。因此, 在研究果蝇运动障碍和其他神经系统疾病的模型时, 或者当检查移动或飞行时, 这种读数在执行大型基因或药物屏幕时特别有用。行为.

这份手稿中提出的岛屿化验协议比现有的/替代的方法具有优势。例如, 视频跟踪移动是非常耗时, 更不适合测试大样本大小。海岛试验是高通量的筛选工具, 并且, 从这个意义上, 是可比较的快速交互式消极 geotaxis (圆环) 试验¹⁶。两者之间的区别在于, 该岛的化验可以检测出更广泛的运动问题;苍蝇无法离开平台, 可能是由机翼 (肌肉/神经) 和/或腿部 (肌肉/神经) 缺陷引起的飞行、跳跃或行走行为的缺陷造成的。另一方面, 环法评估腿 (肌肉/神经) 缺陷引起的攀爬/行走行为的缺陷。如果用户有兴趣在多个行为读数, 海岛分析也可以很容易地结合其他的化验, 如环化验。此外, 遗传学所需的激光器可以很容易地安装在岛形试验箱中, 安装非常简单, 可以方便地移动到温度和光线可以控制的房间。

为了确保在这里描述的海岛试验的成功和重现性, 应遵循若干建议。在实验前至少一天将苍蝇分和转移到实验测试瓶中, 以避免 CO₂或冷麻醉的影响。不要拥挤实验用的小瓶 (每瓶 10-15 只苍蝇; 最好总是每瓶放相同数量的苍蝇)。时刻保持新鲜食物的苍蝇。如果还不熟悉进行化验, 练习投掷飞到平台上, 以最大限度地提高产量。同时练习快速缩回手, 因为它干扰数据分析 (图象分析和飞行计数开始, 在手是从图片以后)。在需要比较的实验中保持环境和实验条件相同 (例如,控件与突变体或不同年龄段的基因型测试)。始终在当天的同一时间进行实验, 并在控制温度和湿度条件下保持小瓶。对于统计能力, 测试每生物复制至少三技术复制。

为了确保此处描述的宏的成功性能, 必须调整网络摄像头和图像设置以达到最大的对比度: 在白色平台上, 苍蝇出现在黑色物体上。当宏数未正确计算时, 请调整对比度设置, 检查是否正确选择了 ROI, 并确保平台上的苍蝇大小高于指定的最小飞行大小设置 (请参见本协议的步骤 8.3)。这些设置只需要定义一次。它们适用于所有的实验, 只要摄像头和平台之间的距离不变。Circularity_min 和最大设置定义了粒子的循环 (粒子 = 计数苍蝇), 将被考虑到分析 (苍蝇 = 计数的对象)。1代表一个完美的圆圈, 0 代表一行¹⁷。由于苍蝇总是存在一定程度的循环 (苍蝇不能显示为直线), "Circularity_max" 设置设置为 1, "Circularity_min" 设置设置为0.4。用户不太可能需要调整这些设置。

当一只苍蝇靠近站台的边界时, 这个宏偶尔会计算错误。这可能发生, 如果苍蝇不能飞, 但进出用户定义的 ROI。在大多数情况下, 重新的 ROI (尽可能多地安装到平台) 可以很容易地解决此问题。然而, "海岛分析" 脚本能够检测和纠正不正确的数据计数由苍蝇进出的 ROI 比较好。虽然在这里提出的摄像头的分辨率很高, 足以辨别苍蝇在接近接近相当好, 我们已经实现了额外的算法在图像处理过程中的 "果蝇岛检测" 宏, 如分水岭和侵蚀功能¹⁷。这些便利了在平台上接近的苍蝇的正确划定。此外, 宏无法区分从平台上跳过的苍蝇, 也无法将其从站台上飞离. 尽管如此, 人们普遍认为, 健康的幼蝇在跌落到平台上时会立即飞走, 而老年苍蝇和有运动缺陷的苍蝇在站台上停留的时间更长, 最终会从平台上跳跃或脱落。尽管有这些限制, 化验和分析提供了一个非常精确的运动行为的测量。

为了确保 "岛屿分析" 脚本的成功执行, 用户必须确保在协议中指示的脚本行中输入正确的输入和输出文件路径, 并以正确的文件夹格式提供数据 (如在图 2中)。如果用户发现用于筛选出不可靠的实验数据的条件太严格 (68 行: "count" 列中的第一个值小于或等于 5; 行 71: "count" 列中的第一个值高于平台上抛出的苍蝇总数rm + 3), 通过在 "岛分析" 脚本中的68和71行中的文本前面添加 # 来关闭这些筛选器设置。在这种情况下, 所有数据集都将包括在分析中。或者, 可以通过根据用户需要调整68和71行中的值来更改筛选器设置。"果蝇" 分析宏生成的 "results.txt" 中的计数值中可能的工件也可以手动调整, 并且可以在调整后的数据上重新运行脚本。当用户有兴趣处理超过 10 fps, 或超过十年代的数据, 由 "岛屿分析" 脚本处理的帧数应进行调整。统计分析也可以被用户定义的替代品取代。

一个名为 "示例岛分析" 的文件夹, 包含了使用岛分析获得的图像时间序列的示例, 可以在以下网站中找到: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。下载 "示例岛分析" 文件夹, 并按照本协议中描述的步骤快速熟悉文件存储的结构, 用 "果蝇岛检测" 宏处理图像, 并对 "岛屿检测"脚本.

海岛化验, 结合发达的宏观和分析脚本, 可用于评估和量化的异常运动行为的一个果蝇模型的共济失调-扩张。由于该方法可以有效地应用于不同年龄段, 因此很适合于分析表型的潜在渐进性。

总之, 海岛化验, 结合 "果蝇岛试验" 的宏观和 "岛屿分析" 的脚本, 是一个 cost-effective, 可靠, 高效的分析和量化的运动缺陷的果蝇以高通量的方式运动障碍模型。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.
Fiji	-	-	Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio	-	-	Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R	-	-	Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com