通过智能手机实时跟踪DNA片段分离

摘要

传统的平板凝胶电泳（SGE）实验需要复杂的装置和高的化学消耗。这项工作提出了一个协议，描述了一种在短时间内分离DNA片段的低成本方法。

摘要

板状凝胶电泳（SGE）是分离DNA片段的最常用方法;因此，它广泛应用于生物学等领域。然而，传统的SGE协议相当乏味，实验需要很长时间。此外，SGE实验中的化学消耗量非常高。这项工作提出了一种基于SGE芯片分离DNA片段的简单方法。该芯片由雕刻机制成。两个塑料片用于光信号的激发和发射波长。通过智能手机收集DNA条带的荧光信号。为了验证该方法，分离出50,100和1,000bp DNA梯。结果表明，使用该方法可以在12分钟内解析出小于5,000bp的DNA梯度，分辨率高，表明它是传统SGE方法的理想替代品。

引言

板状凝胶电泳（SGE）是DNA片段分离最有效的方法1,2,3,4,5 ^，因此被认为是生物化学和生物学分析中的通用工具6,7,8。然而，许多实验表明，SGE受到以下四个问题的限制:（1）分离需要很多小时甚至几天; （2）化学品消耗量非常高; （3）需要复杂的装置（ 例如， 2D电泳池，电泳电源和凝胶成像系统）; （4）实验完成后，凝胶成像系统只能观察分离的DNA片段。此外，SGE ⁹中通常使用的溴化乙锭（EtBr）ass ="xref"> 10，是致突变性和致癌性^11,12 。因此，在装载含有EtBr的凝胶时，应始终佩戴手套。

与SGE相比，毛细管电泳（CE）具有许多优点，如自动操作，分离时间短，消耗量少等优点，13，14，15，16，17。然而，CE仪器相当昂贵。因此，为了克服这些限制，已经开发了一种用于分离DNA的系统（ 图1 ）。这样的系统不仅可以大大降低化学消耗，还可以节省SGE实验时间（<8分钟），而且可以通过智能手机对琼脂糖凝胶中的DNA分离过程进行实时跟踪。按照本协议中描述的程序，学生们可以可以设计和制造SGE芯片，在芯片中制备琼脂糖凝胶，用智能手机设置简单的SGE系统，并将DNA迁移过程记录在琼脂糖凝胶中。

研究方案

SGE芯片的基本设计

1. 使用任何透明塑料，如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）或聚碳酸酯。
   注:SGE芯片如图1B所示 。 SGE芯片由用于TBE缓冲器的圆柱形孔，用于DNA分离的通道和沿着电极孔嵌入的两条通道组成。
2. 使用激光雕刻机在PMMA块中制造SGE通道阵列。
   注意:芯片的几何参数取决于要分离的DNA的大小。例如，如果DNA片段小于1,000bp，则SGE芯片的最佳信道参数为2.5mm×4.0mm×90mm（宽×深×长）。
3. 基于SGE设计，制造梳子以在芯片中创建用于加载DNA样品的孔。

2.琼脂糖凝胶的制备

1. 通过混合10×TBE（1×TBE =89mM Tris，89mM硼酸和2mM EDTA; pH 8.4）和蒸馏水以1:19的比例。
2. 制备1.0％琼脂糖凝胶，分离100-bp DNA梯。
   注意:0.5x TBE缓冲液中琼脂糖的浓度取决于要分离的DNA片段的大小。
3. 将0.1 g琼脂糖放入烧瓶中，加入10 mL 0.5x TBE缓冲液。
   注意:制备溶液的体积应小于烧瓶容量的1/3。
4. 用防腐膜密封烧瓶，然后在微波（培养基，1.0分钟）中加热琼脂糖/缓冲液混合物。在将烧瓶放入微波炉之前，在爆炸的情况下，在防腐膜中形成一些孔。
5. 将2.7mL熔融的琼脂糖溶液倒入SGE芯片的4个通道。将梳子放入琼脂糖溶液中以形成孔。
   注意:3分钟后，熔化的琼脂糖溶液将在室温下冷却至凝胶状态。
6. 从g去除梳子并加入0.9mL 0.5x TBE缓冲液以覆盖凝胶。

3.在SGE芯片中运行电泳

1. 打开LED光源，并在光源上方放置一条425至505 nm的带通滤光片。
2. 使用涡旋器混合14.4μL的100bp DNA梯和1.6μL的SYBR Green。
3. 在SGE芯片的琼脂糖凝胶的每个孔中加入4μL混合物（ 图2 ）。
4. 将电极放入SGE芯片的两条通道。
5. 在SGE芯片上方放置550至700 nm带通滤波器。
6. 打开电源。将电压设置为180 V（20 V / cm）。打开智能手机记录DNA片段分离过程（ 图3 ）。
7. 电泳10分钟后，关掉电源和LED灯。
8. 清洁SGE芯片。

结果

图4 ， 图5和图6代表了在50,100和1,000bp DNA梯级的凝胶电泳之后的典型结果。实验后，DNA片段分离良好。此外，在SGE芯片的4个通道中分离相同的样品，显示出相同尺寸的DNA片段在每个实验中移动相同的距离。

DNA梯度的分离性能可以通过分析迁移距离与DNA大小对数的关系进行评估;因此，SGE可用于计算未知DNA...

讨论

琼脂糖凝胶电泳广泛用于分离DNA，RNA和蛋白质。这项工作提出了一种替代传统凝胶电泳方法的新方法。结果表明，在这样一个小的组装装置中，50,100和1,000bp的DNA梯子可以很好地分离。该方法的优点在于不仅可以将化学消耗少的核酸分开，还可以记录分离过程。尽管DNA片段在图2中看起来很宽，但可以通过优化SGE芯片的参数和琼脂糖凝胶的浓度来改善结果。此外，如果在芯片?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10×TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
50 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3421A
100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
1 kbp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3426A
SYBR GREEN	Takara Bio Inc.	5760A
Agarose	Sigma-Aldrich Corporate	V900510