JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

细胞色素 P450s 致癌亚硝胺的α-羟基化是公认的代谢途径, 产生 DNA 损伤的中间体, 导致突变。然而, 新的数据表明进一步的氧化 nitrosamides 可能发生。我们描述了一个一般的方法, 检测 nitrosamides 产生的体外细胞色素 P450-catalyzed 代谢的亚硝胺。

摘要

N-亚硝胺是一种公认的环境致癌物质, 需要细胞色素 P450 氧化来表现活性。代谢活化机制包括自发分解为 DNA 烷剂的α-hydroxynitrosamines 的形成。DNA 损伤的积累和由此产生的突变最终会导致癌症。新的证据表明, α-hydroxynitrosamines 可以进一步氧化到 nitrosamides processively 细胞色素 P450s。因为 nitrosamides 一般比α-hydroxynitrosamines 更稳定, 也可以烷基化 DNA, nitrosamides 可能在癌变中起到作用。在本报告中, 我们描述了一个一般的协议, 评估 nitrosamide 生产从体外细胞色素 P450-catalyzed 代谢亚硝胺。该协议采用了一般的方法合成相关的 nitrosamides 和一个体外细胞色素 P450 代谢测定的液相色谱-nanospray 电离-高分辨率串联质谱检测。此方法在示例研究中检测到′-nitrosonorcotinine 作为′nitrosonornicotine 的次要代谢物。该方法具有较高的灵敏度和选择性, 是由于质量检测准确。该方法在多种硝细胞色素 P450 系统中的应用将有助于确定这种转化的普遍性。由于细胞色素 P450s 的多态性和活动性的变化, 更好地了解 nitrosamide 的形成有助于个别癌症风险评估。

引言

N-亚硝胺是一种在饮食、烟草制品和一般环境中发现的大量致癌物质;它们也可以在人体内形成内1。超过 300 N-硝基化合物已经被测试和 #62; 90% 被评估了作为致癌物在动物模型2,3。为了展示它们的致癌性, 这些化合物必须首先激活细胞色素 P450s1,2,3。研究表明, 细胞色素 P450s 容易氧化亚硝胺为α-hydroxynitrosamines (图 1), 这是高度活性化合物与半衰期的〜 5 s 之前自发分解到 alkyldiazohydroxides。后者可以在丢失 H2O 和 N2之后烷基化 DNA。由此产生的 DNA 加, 如果未, 可以导致突变, 如果在关键的 onco 或抑癌基因, 导致癌症的发展1。因此, 为了充分了解细胞色素 P450 氧化致癌亚硝胺的代谢途径、DNA 加和下游代谢产物, 已经花费了大量的精力。这些知识在个人癌症风险评估中具有潜在的应用价值4。

figure-introduction-781
图 1: 一般和建议的亚硝胺代谢。
亚硝胺 (1) 被 P450s 氧化为α-hydroxynitrosamines (2), 自发分解为 alkyldiazohydroxides (3)。这些化合物可以与 dna 结合形成 dna 加。假设2被 P450s 进一步氧化为 nitrosamides 4。这些可以直接绑定到 dna, 形成新的 dna 加或水解到3 , 形成已知的 dna 加。r1和 r2表示任何烷基组。请单击此处查看此图的较大版本.

虽然α-hydroxynitrosamine 假说得到了大量数据的坚实支持, 但也存在一些不一致之处。主要的一个是α-hydroxynitrosamines 的短半衰期5,6。众所周知, 这些化合物是在内质网膜和后来的烷基化核 DNA 中产生的。鉴于他们的生命的几秒钟, 这是令人费解的这些中间体如何生存所需的旅行, 虽然胞。一个假说是, α-hydroxynitrosamines 的一部分被 processively 氧化为 nitrosamides7,8, 在比较9中相当稳定。这可能会发生通过保留α-hydroxynitrosamines 在细胞色素 P450 活性部位。这种类型的氧化的先例已经看到与尼古丁10, 酒精的11, 和简单的 alkylnitrosamines12,13。另外, nitrosamides 是直接作用的致癌物质2,3。根据它们的反应性9, 这些化合物被认为产生的 dna 加与α-hydroxynitrosamines 和新的, 未经探索的 dna 加 (图 1) 的结果相同。因此, 这一假说不仅解释了通过胞的运输, 也说明了 DNA 损伤产物的形成。

本文介绍了一种用于评价亚硝胺的细胞色素 P450-mediated 转化为 nitrosamides 的体外的通用协议。先前报告的′-nitrosonornicotine (NNN) 转换为′-nitrosonorcotinine (NNC) 的细胞色素 P450 2A6 被展示为示例14。该协议在广泛的基质酶系统的应用将有助于确定 nitrosamides 在整体硝代谢中的重要性。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 材料和常规过程

  1. 将 NNN 合成为以前描述的 15 。获得 norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, 再生系统, 0.5x 和 #160; 反应缓冲器, 以及试剂级商业来源的所有其他化学品或溶剂.
  2. 在 500 MHz 光谱仪上记录核磁共振谱。报告化学变化为每百万分之 (ppm)。使用残余溶剂峰值作为内部参考为 1 H-nmr (7.26 ppm CDCl 3 ) 和 13 C-nmr (77.2 ppm CDCl 3 ).
    注意: 峰值分裂使用了以下简称: s = 单线态, d = 双峰, dd = 双峰的双峰, dt = 三胞胎的双峰, dq = 双峰的四重奏, ddd = 双峰的双峰, 和 m = multiplet.
  3. 对 LTQ Orbitrap Velos 上所选化合物执行高分辨率质谱 (人力资源), 并将数据报告为 m/z .
  4. 使用金预硅胶薄层色谱片 (40 毫米 x 80 毫米, 0.2 毫米厚) 与 254 nm 荧光指示剂 (tlc)。通过 UV 灯照射来可视化薄层色板.
  5. 在60和 #197 上执行闪光色谱; 70-150 目硅胶使用 1.5 cm x 15 cm 玻璃柱.

2。nitrosamide 阳性控制 ( N & #8242; -nitrosonorcotinine, NNC)

  1. 干燥, 在烤箱过夜 (16 小时, 〜140和 #176; C), 一个25毫升, 圆底烧瓶含有磁性搅拌棒。早上, 在 n 2 流下冷却烧瓶, 同时使用油起泡使 n 2 流速保持在每秒一个气泡下.
    注: 冷却后, 不需要在 N 2 下保持烧瓶的预防措施.
  2. 在通风罩中添加 norcotinine (31.8 毫克、0.196 摩尔)、醋酸酐 (5 毫升) 和乙酸 (1 毫升) 到冷却烧瓶中。在冷却到0和 #176 时, 将此混合物连续搅拌; C 冰浴.
    警告: 醋酸酐和乙酸具有腐蚀性.
  3. 添加纳米 2 (33.3 毫克, 0.483 摩尔) 在一个部分和连续搅拌的混合物为2.5 小时. 监测反应进展的 TLC (100% EtOAc, R f = 0.19, 参见步骤 1.4).
    注: 在这段时间, 混合物将变得越来越黄与偶尔起泡.
  4. 通过将混合物倒入 ice-cold H 2 O (18 毫升) 来淬火反应。在 100 ml 分漏斗中, 立即用18毫升 CH 2 Cl 2 提取水溶液。用 CH 2 Cl 2 (9 毫升) 将水层至少再抽出2次.
  5. 干燥100毫克 MgSO 的混合有机物 4 用于2分钟的过滤, 并通过旋转蒸发浓缩溶液以产生原油、黄油。在蒸发过程中, 将水浴加热到30和 #176; C.
    注意: 如果化合物在 CH 2 Cl 2 中被溶解, 并且该解决方案在黑暗中存储在 2-8 和 #176 中, 则可以暂停该协议; C.
  6. 用硅胶作为固定相和 100% EtOAc 为淋洗 16 , 通过柱层析 (见步骤 1.5) 净化粗化合物.
    警告: NNC 和相关的 nitrosamides 应小心处理, 因为它们被认为是人类致癌物.
  7. 溶解 CDCl 中的纯化合物 3 并使用 NMR (参见步骤 1.2) 确认结构并确定此解决方案的浓度 17 。将此解决方案存储在 2-8 和 #176 的黑暗中, 直到需要为止.
    注意: 此解决方案将用作 体外 检测 (步骤 3.5) 中的正向控制。在支持信息中提供了核磁共振波谱和化学位移.
  8. 使用纯 NNC 解决方案, 通过在步骤1.3 和4.3 中描述的参数直接注入高分辨率质谱仪 (人力资源), 确定准确的母体质量并测定产品离子质量.
    注: 产品质量将用于检测该化合物在 体外 代谢试验 (步骤 4.3).

3。一个例子 nitrosamine-P450 体外 孵化

  1. 删除 P450 2A6 Baculosomes, 生动-再生系统, 和 10 mM NADP + 库存解决方案从-80 和 #176; C 冷冻, 让他们解冻冰。一旦解冻, 稀释 Baculosomes 和再生系统1:10 和1:50 分别, 成一个单一的1毫升管与0.5X 反应缓冲器。同样, 添加3和 #956; NADP + 库存解决方案为97和 #956; l 0.5X 反应缓冲器.
    注意: NADP + 是光敏的。通过将容器包装在铝箔中来保护此解决方案。酶解对冻融循环敏感;将此限制为不超过2个周期。为将来的实验做必要的准备等分.
  2. 对于每个孵化, 添加50和 #956; 酶溶液 l (含 5 pmol P450) 至1毫升管, 包含40和 #956; l 4 和 #956; M NNN 的解决方案, 由反应缓冲器。预孵化这种新的混合物为2分钟, 在37和 #176; C 使用水浴, 然后添加10和 #956; 稀释的 NADP + 解决方案。孵育整个系统 1-30 分钟, 在37和 #176; C.
    注: 使用5分钟的潜伏期 (如 5, 10, 15 分钟等) 将提供足够的 nitrosamide 形成时间的过程.
  3. 在所需的孵育时间后, 先将10和 #956 进行淬火; 3.0 n ZnSO 4 , 然后是10和 #956; 3.0 n Ba (哦) 2 的 l. 漩涡这个解决方案和白色沉淀将形成。离心样品在 8000 x g 为4分钟颗粒的沉淀.
    注: 此步骤不能暂停, 因为形成的 nitrosamides 在水溶液中的稳定性有限。长时间的停顿可能导致错误的底片.
  4. 立即将上清液移出, 并分析2和 #956; 用液体色谱法正 nanoelectrospray 电离高分辨串联质谱法 (LC-NSI + -人力资源/毫秒, 步骤 4.1-4.3).
  5. 对于正控制孵化, 将含有 100 fmol 的合成 NNC 溶液的分蒸发到1毫升的管下, 在 N 的流下为 2 。对这个小瓶, 添加完整的酶系统从步骤3.2 和继续按照描述的步骤 3.3-3.4.
  6. 对于负控制孵化, 执行所描述的实验 (步骤 3.2-3.4), 除替换50和 #956; L 酶溶液与0.5X 反应缓冲器.

4。用于 lc 组件的 lc-NSI + -人力资源/MS

  1. 的 nitrosamide 检测参数的示例, 请将步骤4.2 中的以下多级渐变应用于使用商用、手动包装的 18 C18 (5 和 #956; m) 的 UPLC 系统,100毫米 x 75 和 #956; m, 15 和 #956; m 孔毛细管柱.
  2. 使用 5 mM NH 4 华侨作为溶剂 a 和 MeCN 作为溶剂 b, 通过在1和 #956 的 5% b 处运行, 将样品加载到列上; L/分钟从 0-5 分钟, 然后减慢流速到0.3 和 #956; 之后的升/分钟。接下来, 运行从5到 20% b 以上4分钟的渐变, 后跟一个斜坡到 55% b 以上10分钟, 然后 re-equilibration 到 5% b.
  3. 在 LTQ Orbitrap 上执行 LC-NSI + -人力资源/MS。通过全扫描和 MS 2 碎片监视 NNC。以6万的分辨率进行全扫描, 并以 5 ppm 的质量公差提取准确的母质量 (192.07670)。使用 ms 2 碎片分离父离子 (2.0) 和由碰撞引发的离解 (CID) 与 25 eV 的碰撞能量, 分辨率 1.5万, 和扫描时间30毫秒提取的产品离子的准确质量 NNC ( m/z 192 m/z 134.04739 和 162.07874) 的质量公差为 5 ppm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

基于白色et al的工作。19, norcotinine 是硝化 NNC 清洁和高产 (80-92%), 以产生一个标准的体外实验。一个成功的反应的结构证据获得了从光谱分析包括1H 核磁共振, 13C 核磁共振, 舒适, 和 HSQC (支持信息) 与人力资源证实了父质量 [M + h]+在 5 ppm 的理论值 (图 2)。MS2的碎片 NNC 被用来确定最丰富的?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

阐明亚硝胺的代谢是了解其致癌性的重要组成部分。由于涉及的细胞色素 P450s 和其他代谢酶是多态的, 进一步应用这一知识可能会发现高危个体1,4。新的数据表明, 进一步氧化α-hydroxynitrosamines, 推定主要代谢物的亚硝胺参与 DNA 结合, 以 nitrosamides 是可能的;然而, 这并没有在广泛的基板上进行强有力的测试。我们已经描述了一个协议来确定性氧化亚硝胺的...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了格兰特号的支持。CA-81301 来自国家癌症研究所我们感谢鲍勃的编辑协助, Dr. 彼得 Villalta 和鲁迅的质谱协助分析生物化学共享资源共济会癌症中心, 和 Dr. 亚当 t. Zarth 和 Dr. 安娜 k. 米歇尔的宝贵讨论和输入。分析生物化学共享资源由国家癌症研究院癌症中心资助 CA-77598 部分支持

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
NorcotinineAKoS GmbH (Steinen, Germany)CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Acetic acidSigma-Aldrich695092
Acetic AnhydrideSigma-Aldrich242845
Ammonium AcetateSigma-Aldrich431311
Barium HydroxideSigma-Aldrich433373
D-ChloroformSigma-Aldrich151823
HPLC AcetonitrileSigma-Aldrich34998
Magnesium SulfateSigma-AldrichM7506
Methylene ChlorideSigma-Aldrich34856
Sodium NitriteSigma-Aldrich237213
ViVid CYP2A6 Blue Screening KitLife TechnologiesPV6140
Zinc SulfateSigma-Aldrich221376
0.5 mL tubesFisherAB0533
100 mL round bottom flaskSigma-AldrichZ510424
125 mL Erlenmeyer flaskSigma-AldrichCLS4980125
125 mL Separatory FunnelSigma-AldrichZ261017
25 mL round bottom flaskSigma-AldrichZ278262
500 MHz NMR SpectrometerBruker
Allegra X-22R CentrifugeBeckman-Coulter
LC vialsChromTechCTC–0957–BOND
LTQ Orbitrap VelosThermo Scientific
Magnetic Stir barSigma-AldrichZ127035
NMR tubeSigma-AldrichZ274682
P1000, P200, and P10 pipettesEppendorf
Rotary evaporatorSigma-AldrichZ691410
RSLCnano UPLC systemThermo Scientific
Shaking Water BathFisherFSSWB15
Stir plateSigma-AldrichCLS6795420
PicoFrit ColumnNew ObjectivePF3607515N5
Luna C18, 5 umPhenomenex535913-1

参考文献

  1. Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
  2. Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
  3. Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
  4. Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
  5. Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
  6. Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
  7. Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
  8. Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
  9. Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
  10. von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
  11. Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
  12. Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
  13. Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
  14. Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
  15. Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
  16. Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
  17. Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
  18. van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
  19. White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
  20. Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
  21. Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
  22. Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
  23. von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

127nitrosamideP450

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。