活体果蝇卵巢组织中卵泡干细胞谱系的细胞内 pH 值的成像方法

Sumitra Tatapudy; Marimar Benitez; Todd Nystul

doi:10.3791/56316

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摘要

我们为活体果蝇卵巢组织中的上皮干细胞谱系的细胞内 pH 的成像提供了一个协议。我们描述的方法来产生转基因苍蝇表达 ph 生物传感器, mCherry::p hluorin, 图像的生物传感器使用定量荧光成像, 生成标准曲线, 并转换荧光强度值的 ph 值。

摘要

细胞内 pH 值 (pHi) 的变化在调节许多细胞功能, 包括新陈代谢、增殖和分化方面起着重要作用。通常, phi 动力学是确定的培养细胞, 这是经得起测量和实验操纵 phi。然而, 最近的新工具和方法的发展使得有可能研究皮动力学在完整的, 活组织。对于果蝇的研究, 一个重要的发展是产生一个携带 pHi 生物传感器的转基因线, mCherry::p hluorin。在这里, 我们描述了一个协议, 我们经常使用的成像直播果蝇ovarioles 在 mCherry 的上皮卵泡干细胞 (FSC) 谱系中测量φ::p hluorin 转基因野生型品系;然而, 这里描述的方法可以很容易地适应其他组织, 包括翼盘和眼上皮。我们描述的技术表达 mCherry::p hluorin 在 FSC 的血统, 维持卵巢组织在现场成像, 并获取和分析图像, 以获得 pHi 值。

引言

最近的研究揭示了一个角色的变化在 pHi 细胞分化和发育不良在体内¹^,²。这些研究发现, 在同一类型的细胞中, pHi 在相同的分化阶段是非常一致的, 但它随着细胞从一个阶段过渡到另一个。在某些情况下, 阻断皮下的改变会部分地破坏分化, 这表明 phi 的变化不仅是细胞命运改变的结果, 反而有助于促进细胞命运的改变, 也许通过对 pH 敏感的调控作用分化所需的蛋白质或化学反应。未来的研究有可能揭示更多的洞察力的许多不同的作用, pHi 动力学在体内。然而, 研究 phi 在分化过程中的一个挑战是在体内获得精确的φ测量。与其他分化特征不同, 如细胞形态学和基因表达的变化, φ是细胞的不稳定的化学性质, 是不保存在细胞, 已固定和化的标准方法。此外, pHi 可能不稳定的细胞, 是压力或死亡的实验操作的结果。因此, 在测量 pHi 时保持细胞存活和尽可能健康是很重要的。有几种重要的染料可用于在培养基中测量细胞的φ³, 但在许多情况下, 它们不适合用于活体研究, 因为它们不能深入或均匀地穿透组织以提供精确的测量.

为了绕过染料渗透不良的问题, 我们和其他人使用了一个基因编码探针, mCherry::p hluorin⁴^,⁵^,⁶^,⁷, 可以在单元格中明确表示类型的兴趣和影像活组织。pHluorin 是一个变种的 GFP 与较高的 pKa (〜 7.0 vs. 4.0), 折叠更容易在较高的 pH 值;因此, 细胞中 pHluorin 分子的总荧光强度随着φ⁸的增加而增加。重要的是, 荧光在皮值的正常胞浆范围内是线性的。相比之下, mCherry (pKa ~ 4.5) 的荧光对胞浆范围内的 pH 变化不敏感。这两个记者是共用一个单一的嵌合蛋白, 由单一的开放阅读框架编码, 所以他们总是在同等数量的存在。因此, pHluorin 与 mCherry 荧光强度的比值提供了对每个细胞中的探针浓度进行归一化的φ的测量。然后, 该比值可以转换为φ值的估计使用一个标准的曲线, 这是产生的 pHluorin 的 mCherry 比例从组织已经平衡已知的 pH 值。

在这里, 我们描述了使用 mCherry 的方法::p hluorin 测量的上皮 FSC 谱系的皮在果蝇卵巢。该良好组织已被用于模型的许多不同方面的上皮生物学, 如干细胞自我更新和分化⁹^,¹⁰^,¹¹, 集体细胞迁移¹², 以及单元极性的开发和维护¹³^,¹⁴。卵泡上皮是由两个演产生的, 它们驻留在组织的前边缘, 结构称为 germarium¹⁵^,¹⁶。这些细胞在成年期间定期分裂, 以自我和产生后代, 称为 prefollicle 细胞 (全氟化), 可以重新进入利基, 成为一个 FSC 或分化成三种不同的卵泡细胞类型: 极性细胞, 茎细胞, 或主体卵泡细胞。我们先前显示, 在野生组织中, phi 在分化的早期阶段稳步增加, 从演的φ6.8 到7.0 的全氟化合物, 到7.3 的卵泡细胞²。通过干扰无所不在表达的钠/质子交换器, DNhe2, 阻止这种增加, 严重损害了 pFC 的分化, 而通过过度表现的DNhe2导致轻度过量分化型.这些结果表明, pHi 是稳定地保持在早期 FSC 谱系, 它可以实验增加或减少在体内。这里描述的方法可以用来测量φ在野生组织或各种形式的突变组织, 包括 rna 干扰或过度表达使用 Gal4 的兴趣, 和有丝分裂克隆。