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摘要

报道了一种分子磁镊 quadruplexes 的操作平台, 可以对各种蛋白质的 G4 稳定性和调节进行研究。

摘要

非标准核酸二级结构 G quadruplexes (G4) 涉及不同的细胞过程, 如 DNA 复制, 转录, RNA 处理, 和端粒伸长。在这些过程中, 各种蛋白质结合, 并解决 G4 结构, 以履行其功能。由于 G4 的功能往往取决于其折叠结构的稳定性, 所以研究 G4 结合蛋白如何调节 G4 的稳定性是很重要的。这项工作提出了一种使用磁性镊子操作单 G4 分子的方法, 它能够研究 G4 结合蛋白在单个 G4 分子上的实时调节。一般而言, 这种方法适用于研究蛋白质/配体相互作用和各种 DNA 或 RNA 二级结构的规则的广泛应用。

引言

四-搁浅的 DNA 或 RNA G4 结构在许多重要的生物过程中扮演重要角色1。许多蛋白质涉及 G4 结合和调节, 包括端粒结合蛋白 (端粒酶, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, 转录因子 (核仁, PARP1)3, RNA 处理蛋白 (hnRNP A1,hnRNP A2)4, 旋 (土地管理局, FANCJ, RHAU, 警告, Dna2, Pif1)5, 和 DNA 复制相关的蛋白质 (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6。蛋白质结合能稳定或破坏 G4 结构;从而调节后续的生物功能。采用紫外 (UV) 或循环二 (CD) 方法测定了 G4 的稳定性.7。然而, 这些条件是不生理相关的, 很难适用于研究结合蛋白的影响7。

在分子操作技术的快速发展, 使研究的折叠和展开的生物, 如 DNA 或蛋白质, 在分子水平与纳米分辨率实时8。原子力显微镜 (AFM)、光镊和磁性镊子是最常用的分子操作方法。与 AFM 和光学镊子9相比, 磁性镊子可以使用抗技术10、11, 在几天内稳定地测量单个分子的折叠展开动力学。

在这里, 一个分子操作平台使用磁性镊子研究 G4 稳定性的调节结合蛋白报告12,13。这项工作概述了基本的方法, 包括样品和流动通道的准备, 磁性镊子的设置, 和力量校准。3步所述的力控制和抗协议允许在各种力控制下进行长时间测量, 如恒定力 (力钳) 和恒定加载速率 (力-斜坡) 和力跃测量。4步中描述的力校准协议使 #60 的力标定; 1 µm 短系超过 100 pN, 相对误差在10% 以内。在解析 rna G4R1 中扮演重要角色的 rna 旋与富金元素 (RHAU) 旋 (别名 DHX36, G4) 的稳定性的调节示例用于演示此平台13的应用程序。

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研究方案

1. 单分子拉伸的 G4 DNA 的制备

  1. 准备5和 #39;-巯基标记和5和 #39;-生物素标记 dsDNA 处理, 使用 DDNA 聚合酶在 lambda 噬菌体 DNA 模板上使用5和 #39;-巯基和5和 #39;-生物素引物 14 ( 图 1 )。两个 dsDNA 处理都具有高 GC 含量 (和 #62; 60%), 以防止 dna 在高力量或 dna 过度过渡过程中的 dna 熔化 15 .
  2. 根据制造商和 #39 的协议, 使用商业纯化试剂盒纯化 PCR 产品, 并用 BstXI 限制酶进行消化.
  3. 结扎 G4 形成 ssDNA, 侧面 ssDNA 和 dsDNA 处理使用 T4 DNA 连接根据制造商和 #39; s 协议。根据制造商和 #39 的协议, 使用商业纯化试剂盒, 用凝胶萃取法净化结扎后的产品.

2。流道的制备

  1. 片清洗和表面功能化
    1. 将底部片 (#1 5、22毫米和 #215; 32 mm) 和顶部片 (#1 5、20 mm x 20 mm) 放入覆盖玻璃染色罐 (每个罐子可容纳7件片,音量是 ~ 20 毫升)。用蒸馏水冲洗罐子里的片2-5 次.
    2. 在每个罐子中加入〜20毫升的5-40% 洗涤剂溶液, 然后放置在一个超声波清洗浴30分钟, 用蒸馏水冲洗 #62; 10 次清除洗涤剂.
    3. 烘干罐中的片 (〜150和 #176; 警告 、热) 或 N 2 气体。将干的顶片在干燥的柜子里.
    4. 使用等离子 (O 2 气体) 清洗罐中的片10分钟。在10分钟, 准备20毫升的 1% (3-氨基丙基) 烷 (APTES) 溶液在甲醇 ( 小心 , 有毒/易燃)。使用化学油烟机来溶解甲醇中的 APTES.
      注意: 在存储 APTES 解决方案时避免湿度。老 APTES 常引起片表面纳米的问题.
    5. 在等离子清洗后立即将所有 1% APTES 溶液加入罐中, 并孵育1小时. 将废物倒入专用于 1% APTES 甲醇的废弃瓶中。执行与易燃化学品有关的烟罩中的甲醇相关步骤.
    6. 用甲醇和 #62 冲洗罐一次; 蒸馏水10次, 然后用烤箱烘干 (〜150和 #176; 警告 , 热)。将 APTES 涂层的底部片在干燥的柜子里, 如果不使用长达两周.
      注意: 在每个步骤从2.1.1 到2.1.4 之后, 清洗过程可以在下一个步骤之前暂停.
  2. 组装流通道
    1. 准备两个和 #34; 间隔和 #34; , 即 、膜或双面胶带 (〜 4 mm 和 #215; 20 mm), 用于每个通道。将两块垫片放置在 long-edge 的底部片上。在间隔处放置一个顶部片, 形成一个介于 (~ 10 毫米和 #215 之间的流动单元; 20 mm 区域, 图 2A , B ).
    2. 如果膜用作间隔, 则将流通道放置在加热器 (60-120 和 #176; C; 警告 , 热) 为5-10 秒, 而轻轻地按下顶部片的两侧, 以坚持两个片一起由膜。所产生的流量通道的高度为 ~ 100 和 #181; m, 从而该通道的音量是 ~ 20 和 #181; L.
    3. 用硅胶密封通道的长边以避免渗漏。使用硅胶胶水, 使一个小的水槽状结构在每个开放边缘的流通道, 作为一个入口和解决方案的出口.
      注: 输入和退出也可以通过其他方式, 例如 , 通过粘附小塑料环使用蜡.
    4. 将通道存储在干燥的机箱中长达4周.
  3. 将链式 DNA 放到流通道的底部表面
    1. 将氨基包覆的聚苯乙烯微珠 (直径: 3 和 #181; m) 在蒸馏1X 磷酸缓冲盐 (PBS) 缓冲液中稀释200X。涡珠溶液, 然后流入渠道。在通道中孵育30分钟的珠液, 用200和 #181 冲洗掉任何不通珠; 1X PBS 缓冲器.
    2. 调整 (增加/减少) 孵化时间, 以达到每 50 mm x 50 mm 面积1-5 珠的表面密度。存储与参考珠子沉积的通道长达3天.
    3. 稀释 sulfosuccinimidyl 4-(n-基) 环己烷-1-羧酸 (磺会) 粉末成 1X PBS 溶液 (~ 0.5 毫克/毫升)。漩涡的解决方案, 然后流入通道.
      注意: 在使用前准备新鲜的磺-会溶液, 并立即将其添加到通道中, 以避免会的水解.
    4. 在通道中孵育会解决方案30分钟. 通过使用 1X PBS 解决方案中的大量 (1 毫升、50X 的通道容量) 清洗, 删除会解决方案.
      注意: 仔细清洗多余的会。这一步对于 DNA 在片上的结合非常重要.
    5. dna 中继
      1. 将硫醇-生物素标记为 1X PBS, 其 dna 浓度为 0.3 nM。轻轻吸管混合溶液, 将 DNA 溶液流进会涂层通道, 室温孵育30分钟 (约23和 #176; C).
    6. 用200和 #181 轻轻冲洗游离的 DNA; L 的堵塞解决方案, 含有 1X PBS 与10毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.01% 2-基.
    7. 通过在阻塞解决方案中孵化通道 (10 毫克/毫升 BSA, 0.01% 2-基) #62; 2 h; 在这一步之后, 通道就可以进行实验了。所准备的通道可保持在4和 #176; C 为 ~ 1 天.
      注意: 阻断步骤对于减少 DNA 和磁珠对片的非特异性结合是非常重要的.

3。磁性镊子单 dsDNA 绳的设置和识别

  1. 磁性镊子设置
    1. 启动磁镊控制程序。在这里, 磁性镊子是由一个 in-house 编写的 LabVIEW 程序控制的.
    2. 在安装通道前对齐磁铁中心。使用4X 物镜来调整显微镜光轴中磁体的 x 和 y-axis.
    3. 使用计算机控制的机动机械手将磁体沿 z 方向移动 ( 图 2A ), 并将距离设置为 d = 0 ( d : 磁铁和片之间的距离) 当磁铁附着到显微镜上的片.
    4. 程序通过机械手的运动来实现对力的控制, 包括恒定力 ( 即 、常数 d ) 和时变力 F ( t ) ( 即 , 时间变化 d ( t)).
    5. 使用明亮的发光二极管 (LED) 光源, 用于后分散照明的珠子通过目标。用电荷耦合器件 (CCD) 摄像机采集100赫兹采样率的磁珠图像。i >>
  2. 示例设置和标识单 dsDNA 绳
    1. 系缆编队
        在200X 稀释 M-280 中轻轻流动, 顺磁性珠在化验溶液中 (100 毫米氯化钾, 2 毫米氯化镁
      1. 2 , 10 mm 三-pH 7。4) 变成一个通道。孵育10分钟, 使珠子绑定到生物素标记的 DNA 分子固定在会涂层表面通过硫醇标记结束。用200和 #181 的标准反应溶液, 轻轻地洗去 un-tethered 珠.
        注: 与其它商业磁珠 (如 M-270) 相比, M-280 珠对表面具有较低的非特异性约束力.
    2. 将通道安装到显微镜阶段。搜索底部表面的珠子使用100X 油浸泡目标.
    3. 选取曲面上的参照珠和移动的栓珠。在不同的离焦平面上建立参考珠和栓珠的初始图像库.
    4. 对珠子图像的校准
      1. 在实验之前, 使用一个客观的压电驱动器, 以获得在不同的离焦平面上的参考和拴珠图像 20-50 nm, 这是存储为两个独立的珠图像库并分别用散焦距离 ( 图 2D ) 对其进行索引.
        2. 在实验过程中,
    5. x、y、z 位置确定
      1. 在 x-y 平面上通过珠形质心确定磁珠的位置。通过比较当前的磁珠图像和存储在库中的图象, 确定栓珠的高度变化。用自函数分析了磁珠图像的傅里叶变换的功率谱 16 .
    6. 在实验过程中使用参照珠
        的反漂移反馈, 使用压电 #34; 锁定和 #34; 通过低频存储在库中的目标与特定参考磁珠图像之间的距离反馈控制, 使卡住的磁珠图像与存储在库中的特定图像 ( 图 2D ) 具有最佳的相关性.
    7. 通过应用 ~ 65 pN 力确定一个单一的 dsDNA 分子是否是一个单一的 dsDNA 分子, 如果系绳经历特征 DNA 过度过渡 17 , 18 , 19 . 重复该过程, 直到找到一个 dsDNA 的绳索。(请参阅下一节的力量校准和 DNA 过度过渡).

4。磁力钳力校准

  1. 直接确定长 dna (48502 bp 和 #955;-脱氧核糖核酸) 分子的力 (最多 100 pN), 使用磁珠起伏:
    figure-protocol-4876
    ,其中 k B 是玻尔兹曼常量, T 是开尔文刻度中的温度, 和 #948; 2 y 是垂直于磁场和力的方向上的磁珠波动的方差方向.在这个方向上, 磁珠的运动可以被描述为一个钟摆的波动, 长度为 l + r 0 , 其中 l 是沿 DNA 的力方向 (扩展) 的端对边距离, r 0 是珠子的半径 10 ( 图 3A )。
  2. 确定力的校准曲线 F 作为磁体到磁珠距离的函数 d , 以及 f ( d ), 用于使用长和 #955 的不同的珠子;-脱氧核糖核酸。通常, 磁铁和片之间的距离被用来作为 DNA 系绳长度可以被忽略。使 F - d 曲线符合 double-exponential 衰减函数:
    figure-protocol-5512
    , 其中的管接头参数和 #945; 1、#945; 2、#947; 1, #947; 2 是由磁性镊子和参数 C 由磁珠的异质性决定。通过移动 C , 从不同的珠子获得的 F - d 曲线可以重叠 10 ( 图 3B )。
  3. 对单个磁珠进行短 DNA 实验的参数 C 的校准。
    1. 确定基于波动的力需要在比拐角频率高的频率上记录磁珠位置:
      figure-protocol-5891
      , 位置和 #947; 拖动珠的系数。对于高力的短 DNA, 它需要记录频率比100赫兹快, 因此, 不能直接测量的力量, 根据波动与相机。但是, 参数 C 可以通过使用涨落来测量低力范围 (和 #60; 15 pN) 中的力, 并用校准的 F - d 曲线来拟合数据, 以获取参数 C 20 .
    2. 或者, 对于 dsDNA 的实验, 确定参数 C 使用 65 pN ( 图 3C ) 中的 DNA 过度转换, 21 , 22 , 23 通过记录 d 位置, dsDNA 显示了扩展跃迁 (0.6X 长度增加的轮廓长度)。在确定参数 C 后, 计算栓珠的力.
  4. 通过将磁体的运动通过编程来控制加载速率 F ( d ) 的反函数。磁铁应该接近样品双指数.
    注: 这种外推法确定的相对力误差为 10%, 主要由珠半径非均质性 20 引起.

5。G4 在结合蛋白存在和缺失时的单分子操作

  1. 强制斜坡实验
      在识别 dsDNA 绳后, 执行强制增加扫描, 其加载速率为 0.2 pN/秒, 后跟-0.2 pN/秒的强迫死亡扫描。在每一个拉伸周期之后, 在三十年代的 1 pN 中持有 DNA 分子, 让 ssDNA 再到 G4.
  2. 强制跳转实验
    1. 在三十年代的 54 pn 之间循环, 折叠的 G4 可以展开, 1 pn 为 60s, 折叠的 G4-15T 可以再.
  3. 流动蛋白溶液
      在 20 pN 力时流动蛋白质溶液, 以避免将珠子附着在片上。DEAH 盒 RHAU 旋, 它显示了高特异性 G4 结构, 使用了 24 。重组的 果蝇 RHAU (DmRHAU) 旋是在 大肠杆菌 中表达的, 如前所述 25 所描述的那样纯化。在 tetramolecular G4 DNA 基质上测定了 DmRHAU 的 G4 展开活性 13 .
  4. 使用 in-house 编写的 Matlab 程序分析展开的力 14 .

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结果

在图 4中显示了拉伸单个 G4 分子的实验装置。在两个 dsDNA 手柄之间的单 G4 形成序列被拴在片和顺磁珠之间。为了找到一个单一的 dsDNA 栓珠, 通过在恒定加载速率下增加力来进行过度试验。三种测量方法通常用于研究生物分子的折叠和展开: (i) 恒定力测量, (ii) 力-斜坡测量, 和 (iii) 力跳跃测量。由于这个 G4 结构的非常缓慢的展开速率, 平衡折叠展开的...

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讨论

如上所述, 一个研究 G4 DNA 的机械稳定性的平台和 G4 使用分子磁性镊子的蛋白质相互作用的报告。在该平台的基础上, 开发了高效的 G4 DNA 链, 并对 G4 结构的折叠展开动力学和稳定性进行了测量。焦平面锁定使高度稳定的抗控制, 这是重要的检测小结构转变, 如 G4 (步长〜 7 nm) 和与蛋白质的相互作用在缓冲交换实验。该平台最近被用于研究端 G414和 c-myc 启动子 G412?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢孟潘校对手稿。这项工作得到新加坡教育部学术研究基金3层 (MOE2012-T3-1-001) 对彼莱的支持;国家研究基金会通过 Mechanobiology 研究所新加坡彼莱;国家研究基金会, 新加坡总理办公室, 根据其 NRF Investigatorship 方案 (NRF Investigatorship 奖 No。NRF-NRFI2016-03 到彼莱;中央大学基础研究基金 (2017KFYXJJ153) h.y。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA PCR primersIDTDNA preparations
DNA PCR chemicalsNEBDNA preparations
restriction enzyme BstXINEBR0113SDNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)BMH.BIOMEDIA72204flow channel preparation
Decon90Decon Laboratories Limitedflow channel preparation
APTESSigma440140-500MLflow channel preparation
Sulfo-SMCCThermoFisher Scientific22322flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidinThermoFisher Scientific11205Dflow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μmPolysciences, Inc17145-5flow channel preparation
2-MercaptoethanolSigmaM6250-250MLflow channel preparation
Olympus Microscopes IX71OlympusIX71Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721Physik InstrumenteP-721Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100XOlympusMPLAPON-Oil 100XMagnetic tweezers setup
CCD/CMOS cameraAVTPike F-032BMagnetic tweezers setup
Translation linear stagePhysik InstrumenteMoCo DCMagnetic tweezers setup
LEDThorlabsMCWHLMagnetic tweezers setup
Cubic MagnetsSupermagneteMagnetic tweezers setup
LabviewNational InstrumentsMagnetic tweezers setup
OriginPro/MatlabOriginLab/MathWorksData analysis

参考文献

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