非人类灵长类动物遗传学的大体积、行为相关光照

摘要

建立了一个组织穿透照明灯的协议, 以提供光超过大体积的最小直径。

摘要

该协议描述了一个大体积的照明灯, 这是为非人类灵长类大脑中的 optogenetic 操纵而开发的。照明灯是一种经蚀刻后的改性塑料光纤, 其发光表面积 #62; 100x。除了描述大容量照明灯的构造外, 本协议还详细介绍了用于确保均匀光分布的质量控制校准。此外, 该协议还描述了插入和移除大容量照明灯的技术。表面和深层结构都可以被照亮。这个大体积的照明灯不需要物理耦合到一个电极, 因为照明灯是由塑料, 而不是玻璃, 它会简单地弯曲的情况下, 传统的光纤将粉碎。因为这个照明灯提供光超过行为相关的组织体积 (≈ 10 mm³) 没有比传统的光纤更大的穿透损伤, 它促进行为研究使用遗传学在非人灵长类动物。

引言

Optogenetic 工具, 允许毫秒精确, light-driven 神经元控制被广泛用于研究啮齿动物和无脊椎动物的功能生理学和行为。然而, 技术上的挑战限制了非人类灵长类大脑中遗传学的使用, 它的体积 ~ 100 x 大于啮齿动物的大脑¹。

为了促进非人类灵长类动物的遗传学研究, 一个照明灯被设计来解决两个相互竞争的目标: 大体积光照和最小穿透损伤。以前试图解决其中一个问题的做法是代价高昂的。束纤维照亮更大的容量, 但以增加的直径, 并且, 因而, 损坏^2,3。锥形玻璃纤维可减少穿透损伤, 但将光线聚焦到发光表面区域和 #60; 100 µm^{2 4,5}。外部的大脑照明通过一个窗口的硬脑膜绕过的挑战, 穿透伤害和可能允许大体积照明, 但它只能用于一些肤浅的大脑区域⁶。

为了创建一个大体积, 小直径的照明灯 (图 1a), 塑料光纤的尖端是热锥和核心和熔覆蚀刻 (图 1b, c)。不同于将光聚焦到一个窄点的锥形光纤, 蚀刻允许光线在尖端的两侧均匀地逸出, 从而在大面积上分布光源 (图 1d, e)。由于穿透损伤与穿透直径成正比, 因此该照明灯没有比传统纤维更大的穿透损伤, 但它有和 #62; 100x. 光发射表面积和光功率的 1/第100更广泛地提供光密度在脑幻影 (1.75% 琼脂糖) (图 1e)。蒙特卡罗模型 (图 1f) 说明了传统光纤和大体积照明灯在光功率密度相等时与发光表面之间的差异。每个照明灯使用集成球体 (图 2a, b) 进行单独校准, 以确保沿尖端均匀分布 (图 2c)。

这种大体积的照明灯已经验证了 optogenetic 操作的行为和神经元射击在非人灵长类动物。纤维针尖长度可以定制的任何大脑区域和每一个动物的个人接受领域的地图。该照明灯可以配对与穿透电极的神经录音, 跨越的长度照明。此外, 由于纤维可以携带任何颜色的可见光, 它可以与任何可用的 optogenetic 分子配对。

研究方案

注意: 所有动物程序都符合 NIH 的指导方针, 并获得了麻省理工学院动物保育委员会的批准.

1. 照明灯制作

1. 使用一对锋利的剪刀切割250和 #181 的部分; m 直径塑料光纤, 至少10厘米长于所需总照明长度.
2. 从塑料光纤的一端取下 15-20 厘米的聚乙烯护套, 使用22口径的钢丝剥皮器.
3. 在表虎钳钳夹中保护纤维的最远端 3-5 厘米的末端.
4. 握住纤维的一端紧扣在一只手固定的稳定拉。纤维应平行于地板, 垂直于副。在整个加热和冷却过程中保持纤维的恒定张力 (下面的步骤1.5 和 1.6), 使纤维保持平直和绷紧.
5. 使用双温热枪的最低设置 (570/1000 和 #176; F), 将纤维的剥离部分加热到直径为 60-100 和 #956; m, 或关于人的头发的直径.
6. 保持纤维上的恒定张力, 同时让纤维冷却。如果不保持张力, 可能会导致纤维卷曲.
7. 在解剖显微镜下确认变薄尖端的直径。另外, 你可以使用卡尺代替。
   1. 如果光纤不够薄, 请根据需要重复步骤1.4 到1.6 以达到所需的笔尖直径.
   2. 可选如果 re-pulling, 则在纤维的最窄部分放置一个小标记, 如果它再次加热, 使热枪的中心目标是纤维的最窄部分.
   3. 如果纤程太薄, 请重新开始.
8. 一旦光纤已完全冷却并且达到了所需的直径, 则从两侧的最窄点将光纤捏3厘米。用一个快速, 尖锐的拉沿轴的纤维, 分离两侧创建一个锥形尖端.
9. 在低功耗下检查锥形尖端 ( 例如, 在解剖显微镜下的 , 4X)。如果笔尖是分叉的或卷曲的 ( 图 1f ), 则丢弃光纤.
10. 准备蚀刻锥形尖端, 把一条实验室胶带放在尖端的末端, 留下最后5毫米暴露。该胶带保护纤维免受蚀刻超过所需的光发射长度。根据靶区的灵长类皮层厚度, 选择该针尖长度。一个较长或较短的长度可以暴露取决于所需的照明长度。如果需要不同的蚀刻尖端长度, 则可以将实验室磁带的边缘从锥形尖端移到更近或更远的地方.
11. 折叠小 (〜1英寸 x 2 英寸) 正方形的5和 #956; m 碳化硅研磨片在拇指和食指之间。将纤维的尖端放在研磨片的两面之间, 用小的圆周运动轻轻地蚀刻纤维, 就像在拇指和食指之间滚动一个 BB。频繁地转动纤维, 以便所有边均匀地被蚀刻。纤维顶端会出现和 #8220; 粗糙和 #8221; 在蚀刻过的区域, un-etched 区域通常看起来平滑.
12. 重复步骤1.11 与3和 #956; m 氧化铝研磨板.
13. 在与蚀刻尖端相对的照明灯的末端贴上一个连接器。这使得照明器可以连接到光缆或激光器.
    注意: 这种方法不同于套圈固定玻璃/二氧化硅光纤的首选方法。由于金属套圈比塑料光纤硬, 因此在胶合后抛光纤维和套圈作为一个单元, 会损坏塑料光纤, 因为在抛光过程中产生的细小金属碎片可以嵌入到平坦的纤维中。
    1. 从照明灯的另一端取下大约5毫米的聚乙烯护套, 使用22口径的钢丝剥皮器.
    2. 用热刀将另一端平切, 以平滑表面.
    3. 抛光与连续地更细的研磨板的相反末端单位: 5 和 #181; m, 3 和 #956; m, 1 和 #956; m 和0.3 和 #181; m.
    4. 将平面相对端插入260和 #181; m 内径不锈钢套圈, 直到它与套圈的一端齐平.
    5. 直观地证实, 相反的一端是平滑和均匀抛光的纤维显微镜.
    6. 将光纤从套圈中取出, 并将套圈垂直贴在表的边缘, 并将光纤指向下方.
    7. 用塑料环氧树脂填充1毫升注射器, 并在注射器上附上一个钝18口径的针头.
    8. 使用针将环氧树脂放入套圈中。完全用环氧树脂填充套圈.
    9. 将光纤插入插芯.
    10. 擦除任何多余的环氧树脂从抛光表面的纤维与湿不起毛的擦拭之前, 如果需要干燥。否则, 过量的环氧树脂可以在 12-24 小时后被去除.
    11. 将纤维轻轻地储存直到校准, 并在套圈上放置一个防尘帽.

2。照明灯校准和质量控制

注意: 这些校准方法用于评估光纤尖端不同距离的光输出非线性。不均匀的光分布通常起因于 #8220; 颠簸和 #8221; 或 #8220; 波浪 #8221; 锥度.

1. 使用光吸收箔 ( 图 2 ) 创建集成球体顶部的光屏蔽膜片。 注意: 在处理轻吸箔时戴上手套, 防止皮肤油脂产生反光的污迹。
   1. 折叠2和 #8221; 4 #8221; 一块光吸收箔在本身形成一个2和 #8221; x 2 和 #8221; 正方形和 #160; 另一种方法是切割2和 #8221; x 2 和 #8221; 正方形与一个轻的吸收的边和一个光反射的边 ( 即 , 一面是标准铝箔);然而, 折叠方法是更安全的, 因为它提供了一个沉闷的边缘处理膜片在下一步. 和 #160;
   2. 将实验室磁带或磁带沿正方形的边缘折叠以绑定横杆边缘。这两者都保持双方在一起, 防止从尖锐的边缘削减.
   3. 使用26口径针在广场中心穿刺一个孔.
   4. 从积分球体上卸下大螺钉盖, 并盖上膜片的开口。把洞放在中间。如果膜片被创造了以一个轻的吸收和一个反射的边, 安置轻的吸收的边和光反射的边, 面对集成球形的里面.
      注意: 为了防止灰尘和碎片进入积分球体, 并保持孔的中心, 确保膜片的外部的集成球体与实验室磁带.
2. 在500和 #181 中测量沿尖端的光输出; m 增量使用微或立体定向臂和集成球体.
   注意: 激光照射时, 应佩戴合适波长的安全护目镜。
   1. 将光纤的另一端连接到激光或光源, 但尚未触发光输出.
   2. 将照明灯固定在立体定向支架上 (preferably 与实验室磁带) 的尖端 7-10 毫米以下的持有人的底部.
   3. 将立体定向支架固定在立体定向臂中.
   4. 将照明灯的尖端与膜片中心的孔对齐。当尖端与横膈膜完全相同的水平时, 微为零.
   5. 关闭房间指示灯并将积分球零除.
   6. 触发激光 (或其他光源), 并使用集成球体测量总的光功率输出.
      注意: 使用尽可能低的光输出进行校准测试.
   7. 降低光纤500和 #181; m 进入集成球体并重复步骤 2.2.6.
   8. 继续将光纤降低到集成球体中, 并在500和 #181 中测量总光输出; m 增量, 直到总的光功率水平关闭.
      警告: 当整个尖端在球体中时, 总的光功率应该是水平的。不要继续降低超过 1-2 毫米超过蚀刻尖端长度的纤维。如果尖端接触到积分球体的底部, 它可能熔化和/或破坏积分球体.
3. 通过绘制总的光功率输出来确认一个均匀蚀刻的光纤, 将其作为光纤被降低到集成球体以确认线性度的函数.

3. 在体内 光照

注意: 在这里, 这些方法使用塑料模型显示, 而不是非人类灵长类.

1. 植入在实验之前, 在感兴趣的大脑区域植入了25毫米直径的记录室.
2. 在实验前进行解剖磁共振成像 (MRI)。在室内放置一个自定义的记录网格, 并用无菌的外科润滑剂填满它, 以允许网格可视化和确定硬脑膜和靶脑结构的水平.
3. 在每个测试会话之前准备一个塔式微驱动器。
   1. 在驱动器上的中间和下部夹具上贴一条带有斜角尖的25口径导向管。使用两个夹具确保导管保持平直。如果需要, 可以手动移动这些夹具.
      注意: 导管可环氧树脂或焊接到夹具上.
   2. 在同一驱动器上的上钳上固定大音量照明器。此夹具连接到驱动马达.
   3. 将大容量的照明灯通过导管完全穿线, 并确认照明灯的尖端延伸过导管的尖端.
      注意: 超过导管尖端的照明灯长度等于从硬脑膜到靶脑区的下边缘的距离, 如确定的 通过 MRI.
   4. 在防腐溶液中浸泡导管和照明灯 ( 如 、chlorohexidine) 进行灭菌.
4. 在干净的室内放置一个自定义的灭菌网格, 并将其固定在预先方向上, 并将螺钉放在会议厅一侧。此处显示的网格有 1 mm 间距;但是, 可以根据需要自定义间距.
   注意: 这应该是相同的网格和方向使用的解剖 MRI.
5. 在记录室中以预先确定的方向保护立体定向微驱动器支架.
6. 用无菌的钝钳将照明器拉起, 从导管中缩回灭菌的照明灯。照明灯尖端应为 5-10 毫米以上的引导管尖端.
   注意: 照明灯将弓向外的引导管和钳。这不会损坏灵活的照明灯.
7. 将微驱动器贴在支架上, 并将导管置于目标网孔中.
8. 降低微驱动器的阶段, 直到引导管刚刚通过硬脑膜的水平.
   注意: 如果需要, 第二个微驱动器与电极可以放在舞台上, 并降低到一个不同的网孔。该电极上的局部场电位将显示一个距离相关的光伪迹, 可用于确定光源位置.
9. 尝试用无菌镊子手动降低照明灯。
   1. 如果有任何阻力, 请收回照明灯 5-10 毫米, 等待10分钟, 让组织和解, 再试一次.
   2. 如果在第二次尝试时仍有阻力, 请将照明灯尖端缩回引导管中, 向下引导管 0.25 mm, 然后重试.
   3. 重复, 直到照明灯通过导水管滑动而无任何阻力.
   4. 降低照明灯, 直到它绷紧.
      警告: 不要用力地推挤照明灯反对抵抗。在这些情况下, 导管通常没有穿透硬脑膜充分。强力推动纤维会使它自身弯曲, 防止纤维进入大脑并可能破坏尖端 ( 图 1g ).
10. 将光源的另一端上的套圈连接到较大的光学设置或激光器上.
11. 确保非人类灵长类动物没有可见光。
    1. 使用黑屏蔽或光吸收箔来完全包含记录塔.
    2. 将所有光学连接放置在由光吸收箔制成的屏蔽信封中.
    3. 用吸光箔或黑色电子胶带屏蔽所有跳线.
    4. 作为一种额外的预防措施, 在非人类灵长类动物后面的实验中放置一个与之相同的浅色发光二极管 (led) 库, 并以2.5 赫兹的频率连续闪烁 led。这可以防止眼睛完全适应黑暗。如果有疏忽的光漏, 这种闪光将有助于防止泄漏作为行为触发.

结果

在非人灵长类动物的大脑容量的照明允许行为相关的 optogenetic 操作。Acker et al.(2016) 使用这个大容量的照明灯与红色被转移的 Halorhodopsin, 下颌⁷研究前额眼睛领域的世俗贡献 (FEF) 到记忆被引导的扫视在二只恒河猴。具体来说, FEF 神经元注射了一个含有颌骨的病毒载体, 然后用红光照亮, 在目标表示、延迟周期或记忆引导的扫视任务的运动准备期间, 使用大体积的照明灯。

讨论

虽然 optogenetic 工具被广泛用于研究啮齿类动物的疾病和生理学, 但对大脑大容量的照明技术的挑战限制了非人类灵长类动物的遗传学的使用。在猴子的开创性研究中使用了大的光功率密度 (~ 100 兆瓦/毫米²到20瓦特/毫米²) 来照亮小容量, 也许和 #60; 1 mm³, 并报告了轻微的行为影响与兴奋 opsins 在皮层^{4, 9、10}...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic optical fiber	Industrial fiber optics	SK-10	250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper	Klein Tools	11047	22 gauge
Vise Clamp	Wilton	11104	Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun	Milwaukee	8975-6	570 / 1,000 °F
Lab marker	VWR	52877
Dissection microscope	VistaVision	82027-156	Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR
Lab tape	VWR	89097-972	4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet	ThorLabs	LF5P	5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet	ThorLabs	LF3P	3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet	ThorLabs	LF1P	1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet	ThorLabs	LF03P	0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife	Industrial fiber optics	IF370012	60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope	ThorLabs	FS201	optional
Stainless Steel Ferrule	Precision fiber optics	MM-FER2003SS-265	265 micron inner diameter
1 mL syringe	BD	14-823-30	Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy	Industrial fiber optics	40 0005
18 gauge blunt needle	BD	305180	1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe)	ThorLabs	KW32	available from many vendors
Light absorbing foil	ThorLabs	BKF12
Electrical tape	3M	Temflex 1700	Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle	BD	305111	0.5 inch length
Micromanipulator	Siskiyou	70750000E	may substitute other brands/models
Steretactic arm	Kopf	1460	may substitute other brands/models
Laser safety goggles	KenTeK	KCM-6012	must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source	vortran	Stradus 473-50	example of blue laser
Integrating sphere	ThorLabs	S142C	Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber	Crist instrument company	6-ICO-J0	Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps	NAN	DRTBL-CMS
Guide tube	Custom	N/A	Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system	NAN	NANDrive
Custom grid design	custom	custom	plans available upon request
Blunt forceps	FischerScientific	08-875-8A	generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers	Neiko	01407A	available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable	ThorLabs	FG200LCC-custom	This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps	ThorLabs	CAPF	Package of 25
ceramic split mating sleeve	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S