非遗传表面修饰的素-生物素系统在牛分枝杆菌卡介苗中的外源抗原表达

摘要

提出了一种新的细菌表面快速抗原显示技术, 它涉及表面法, 其次是暴露于与单体素融合的感兴趣的蛋白质。用选定抗原载入卡介苗, 成功地提高了其免疫原性, 表明表面修饰可以取代传统的遗传方法。

摘要

肺结核 (tb) 是一种严重的传染性疾病, 唯一可用的疫苗是牛牛卡介苗 Guérin (BCG) 是安全和有效的保护儿童的严重结核脑膜炎和某些形式的传播结核, 但未能保护肺结核, 这是最普遍的疾病形式。有前途的战略, 以改善 BCG 目前依赖于其转化的基因编码免疫m 结核)特异抗原和/或互补基因编码共同因素, 将刺激抗原呈现单元格。这些方法的主要局限性包括效率低、稳定性低、表达载体安全程度不确定等。在这项研究中, 我们提出了一种替代方法的疫苗改进, 其中包括卡介苗与外源蛋白的利益的表面上的细菌, 而不是转化与质粒编码相应的基因。首先, 在标准的大肠杆菌表达系统中, 有兴趣的蛋白质与单体素融合, 然后用来装饰化 BCG 的表面。用蛋白抗原修饰的 BCG 表面进行动物实验, 表明该修饰菌完全免疫, 能够诱导特定的 T 细胞反应。总而言之, 这里所提供的数据强烈支持一种新的、有效的方法来重塑目前的 BCG 疫苗, 取代了传统的与外源核酸互补的方法。

引言

已经提出了各种战略来取代目前的结核疫苗 bcg, 包括蛋白质佐剂系统、病毒向量技术、减毒活的m tb菌株以及基因改造的卡介苗菌株, 以引入基因过度表达 bcg 抗原, 在感染¹或结核分枝杆菌特异抗原在 bcg²中没有充分表达。然而, 基因工程面临着许多障碍, 包括安全级别不确定、耗时过程和表达载体效率低下^4,5。关于改进 BCG, 需要另一种方法来提高免疫原性, 而不需要不确定的基因交替。

在这项研究中, 我们介绍了一种新的策略, 显示在 BCG 细胞表面感兴趣的重组蛋白, 这是基于已知的高亲和性素与生物素的相互作用。这种方法允许快速和可重现的素融合蛋白在表面化卡介苗, 这有助于广泛的操作 bcg, 以达到最大的提高其功效, 同时保持其优良的安全性记录, 观察了几十年的使用。

素亲和性为生物素是极端高 ( K_d = 10⁻¹⁵ M ) 和一旦形成 , 生物素 - 素复合体是非常稳定的 , 并且在变性情况下只可能扰⁶。然而, 这种类型的相互作用作为一种基因转移方法的替代, 长期而可逆的显示重组蛋白是必需的。因此, 我们在这里介绍了一个低亲和力单体素 (K_d = 10⁷ M), 这将导致从表面修饰的 BCG 在抗原呈递细胞内摄取的蛋白质的可逆释放。为了提供一个概念的证明, 我们测试了这种方法使用单体素嵌合体蛋白对应的代理抗原从蛋白 (卵子)^7,8。结果表明, bcg 细胞表面可以方便、快速地用单体素融合蛋白进行修饰, 并且这种与 bcg 表面的结合是稳定和可重复的, 没有细菌生长和生存的可察觉的变化。此外, 我们发现, bcg 装饰与单体素融合与卵子 (AviOVA) 可以诱导免疫反应类似的 bcg 诱导的基因表达相同的抗原都在体外和在体内。这一技术的可逆显示蛋白质的细菌表面是一个有效的替代传统的基因转移方法, 可以提供一个平台的广泛操作卡介苗和进一步应用在疫苗发展.

研究方案

所有动物都按照不列颠哥伦比亚大学动物保育和使用委员会批准的协议进行维护。实验得到动物保育和使用委员会的批准, 并按照加拿大动物保育委员会的指导方针进行。动物保证福利号是 A11-0247。

1. 表达质粒的单体素融合蛋白的生成

1. 子克隆单体素序列¹²成 pDEST17 质粒之间的 "CTC" 和 "GAA" 网站对应的 133-134bp. (即, 介于 6-histag 和 pDEST17 Attr1重组站点) 之间以获得 p17-Avi。
   注: 单体素 DNA 序列如下图所示。三突变引入野生型素获得单体素显示在粗体字符。
   gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggcATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
   agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
   acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
   tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
   attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt
2. 设计底漆两侧的 B1 和反鱼雷B2 网站对应的卵子多肽_757-1035 (I-A ^b-和 H-2K^b限制表位) DNA 序列。底漆序列是: b1-OVA
   GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT 和卷 b2-OVA
   GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC。(b1 和 b2 序列是粗体的.
   1. PCR 放大卵子多肽_757-1035 DNA 序列与上面的引物 pUC57-OVA 质粒作为模板。
   2. 通过特定于站点的体外重组反应 (如, BP Clonase) 将 PCR 产物克隆成 pDONR-221, 以获得 pDONR 卵。
3. 利用 LR Clonase 反应将感兴趣的基因转移到 p17-Avi, 获得 p17-Avi-OVA。
   注: 有关 BP 和 LR 重组克隆的详细信息, 请参阅制造商手册。

2. 单体素融合蛋白的表达、纯化和复用

1. 将 p17-Avi-OVA 质粒转化为大肠杆菌 BL21 并诱导250毫升的大肠杆菌 BL21 培养与 IPTG (0.1 米) 3 小时在37° c.
2. 细菌和包涵体的溶解
   1. 250毫升的诱导 BL21 培养30分钟离心在 4000 x g 和4° c。
   2. 收集10毫升的裂解缓冲液 (50 毫米三盐酸, 150 毫米氯化钠, 6 米胍-hcl, pH 1.5-2.5) 和孵育15分钟在95° c。在一个旋转的室温下通宵孵育。
   3. 离心机30分钟在 1.5万 x g 和4° c 和收集上清液。
3. 用镍 NTA 柱纯化上清 (溶解包涵体分数) 的 Avi 卵。
   1. 用裂解缓冲液稀释包涵体1:2。
   2. 每250毫升的文化衍生包涵体使用4毫升的镍 NTA 树脂。
   3. 用10毫升的溶解缓冲液 (pH 7.0) 冲洗3x。
   4. 洗与10毫升的洗脱缓冲液 (裂解缓冲液 pH 7.0 与250毫米咪唑)。
4. 再洗蛋白由渐进稀释 (1:10) 和快速涡流在三缓冲 (pH 7.5) 含有1毫米的双制式, 200 毫米 NDSB256 (3 (Benzyldimethylammonio) 磺), 0.5 毫米吐温 80, 500 毫米精氨酸, 200 毫米氯化钠为30分钟室温。
5. De 盐和缓冲交换折叠蛋白质从三缓冲入 PBS 与蛋白质集中器根据制造商的协议。
6. 在 3500 x g和4° c 的情况下, 用离心法去除聚合体30分钟, 并在-20 ° c 储存可溶性蛋白等分。

3. BCG 细胞表面法

1. 种植卡介苗在 Middlebrook 7H9 汤与 10% OADC (油酸, 白蛋白和葡萄糖溶液) 和0.05% 吐温80在37° c 在一个振动筛平台在 50 rpm 直到 OD = 0.5-1。
   注: bcg 是生物安全等级2病原体, 所有有关 bcg 的实验都应在生物安全柜内进行, 并配备适当的个人防护设备。
2. 洗涤 10⁹ BCG 3 次与500µL 的冰冷内毒素免费 PBS 加 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0)。在无菌内毒素的 PBS 中悬浮卡介苗颗粒。
3. 立即使用前, 准备1毫升的10毫米磺-NHS SS 生物素在无菌过滤水中。
   1. 孵育细菌与1毫升的0.5 毫米磺-NHS SS 生物素在室温下为30分钟。
4. 用500µL 的冰冷 PBST 清洗标记的细菌3次, 以去除非反应的法试剂。
   1. 再悬浮颗粒在1毫升的 PBST。
5. 为了评估法效率, 染色 10⁸化卡介苗与亲和 FITC (1:100, 25 µL) 在室温下20分钟。
   1. 在室温下孵育1毫升2% 粉煤灰中的染色菌, 然后通过流式细胞仪分析对法的含量进行检测。

4. 化分枝杆菌的表型: 生长和存活

1. 用 10% OADC (油酸、白蛋白和葡萄糖溶液) 和0.05% 吐温80在37° c 的 Middlebrook 7H9 汤中生长 BCG 菌株, 在 50 rpm 的振动筛平台上。
   1. 在8天的时间内记录细菌培养的光学密度 (OD₆₀₀)。
2. 使用 BCG-卢克 (以前描述的⁹) 来检测巨噬细胞中细菌的存活。
   1. 感染 RAW264.7 细胞与化卡介苗-卢克 (莫伊 10:1) 或未经治疗的 bcg-卢克 (控制) 和孵化在37° c 超过48小时的时间内。
   2. 冲洗细胞单分子, 然后溶解 0.025% SDS 释放摄入的细菌。
   3. 用荧光检测系统和计测量生物发光的生产。
      注意: 发光信号是细菌生存能力的指示。有关荧光化验的详情, 请参阅制造商手册。

5. 单体素融合蛋白与化卡介苗表面的结合

1. 混合 5 x 10⁸化卡介苗与 Avi 蛋白 (10 微克/毫升决赛在 PBS t) 为 1 h 在室温下在振动筛平台。
2. 洗涤细菌3次与500µL 冰冷 PBST 和着色兔抗素抗体 (Ab) (1:100 稀释, 先前描述的¹⁰) 为20分钟室温, 然后与 FITC 共轭山羊抗兔 IgG Ab 在相同的条件。
3. 用500µL PBST 洗涤细菌3次, 用流式细胞仪分析表面装饰的程度。

6. 分枝杆菌冻干

1. Biotinylate 细菌根据步骤 3.1-3.4 和外套化细菌与 Avi 卵根据步5.1。
2. 分化和涂布细菌 (10⁸), 用 PBS 洗涤, 再在0.5 毫升冻干培养基中重新悬浮 (25% Sauton 培养基、75% H₂O 和 1.5% Na 谷氨酸)。
3. 将细菌转移到玻璃瓶中, 在一夜之间冷冻-80 ° c 冷冻。
4. Lyophilize 用冷冻干燥机为24小时装满和冰冻的玻璃瓶。
5. 在室温下储存干燥样品, 必要时在 PBS 中进行重组。
6. 重复步骤3.5 以评估法和表面涂层的稳定性。

7. 吞噬试验

1. 在10厘米直径培养皿中生长生264.7 巨噬细胞, 在含有 5% FCS 的 DMEM 培养基中, 1% 每种 l-谷氨酰胺、HEPES、非必需氨基酸、青霉素和链霉素直到 70-80% 70-100。
2. 种子 2 x 10⁶生264.7 巨噬细胞在 6-井板中。允许单元格在37° c 和 5% CO₂的夜间粘附。
3. 根据步骤 3.1-3.4 和 5.1, 生成 DsRed bcg (以前描述的⁹), 用 avi 卵 (DsRed 卡介苗-avi-卵) 装饰。
4. 用 DsRed 卡介苗-Avi-卵或未经处理的 DsRed 卡介苗感染原细胞, 在莫伊20:1 为24小时, 在37° c。
5. 洗涤细胞三次和处理使用1毫升0.25% 胰蛋白酶在37° c 为10分钟去除部分分离的细菌。
6. 室温下20分钟, 在 PBS 中固定2.5% 的粉煤灰。
7. 用 PBS 冲洗 3x, 用流式细胞仪分析。

8. 化卡介苗在巨噬细胞内的细胞内贩运

1. 荧光显微镜
   1. 种子 3 x 10⁵生264.7 巨噬细胞在片的 24-井板上。允许单元格在37° c 和 5% CO₂的夜间粘附。
   2. 在37° c 和 5% CO₂的维持培养基中, 以分枝杆菌 (莫伊 10:1) 感染巨噬细胞, 4 至 24 h。
   3. 清洗细胞和处理去除附着的表面, 不摄入细菌, 如步骤7.5。
   4. 在 pbs 中, 在室温下20分钟修复2.5% 只粉煤灰中的感染细胞, 然后用 pbs 3 冲洗。
   5. Permeabilize 细胞在封闭/性缓冲 (0.1% 海卫 X-100, 3% BSA 在 PBS) 在室温下20分钟。
      1. 使用特定的兴趣抗体 (例如, 兔抗素 Ab) 在10微克/毫升, 在性缓冲20分钟在室温下其次抗体 (如, FITC 山羊抗兔 IgG) 20 分钟。
   6. 冲洗细胞3x 与 PBS, 一旦与水, 并在幻灯片上安装10μ l 水的安装介质, 以尽量减少荧光漂白。
   7. 使用带有 63 x/1.4 计划-色差目标的荧光显微镜, 通过数字共聚焦显微镜检查幻灯片。使用与显微镜软件耦合的数码相机记录图像。
2. 免疫染色与电镜
   1. 种子 2 x 10⁶生264.7 巨噬细胞在 6-井板中。
   2. 用4% 的粉煤灰固定在室温下4小时的卡介苗感染的巨噬细胞。
   3. 用 PBS 洗两次样品。
   4. 在4% 低熔点琼脂糖中嵌入样品, 在70% 乙醇中脱水。
   5. 将样品转移到丙烯酸树脂和聚合50° c。
   6. 用切片切割出 60 nm 剖面, 并在镍网格上收集剖面。
   7. 用10微克/毫升素抗体在室温或4° c 夜间在孵化溶液 (PBS 和 0.1% BSA) 中标记样品, 然后用孵化液金-共轭 F (ab)₂超小山羊抗兔 IgG (1/20) 在室温下为1小时温度在孵化溶液中。
   8. 用蒸馏水冲洗切片, 2% 戊二醛染色, 再冲洗, 晾干, 用电子显微镜检查。

9. 动物免疫和器官加工

注: 所有步骤应在生物安全柜中完成。

1. 通过化和蛋白质涂层细菌通过 27_1/2G 针10次, 使单细胞悬浮。
2. 采取 1 x 10⁶细菌在100μ l 无内毒素 PBS 和免疫雌性 C57BL/6 小鼠 (I-a^b, H-2K^b, 5-6 星期老) 皮下的颈背。
   1. 单独注射100μ l 的 PBS 控制小鼠。
3. 安乐免疫小鼠20天后经 CO₂吸入后经宫颈脱位后免疫接种。
   1. 分离脾脏并将其转化为 RPMI 介质。
4. 通过一个5毫升注射器柱塞的70µm 细胞过滤器捣碎脾脏。
   1. 用5毫升的 RPMI 洗。离心机 (800 x g, 3 分钟) 以隔离单个单元悬浮。
   2. 用小鼠生物素阳性选择试剂盒和 biotin-Ter119/Erythroid 细胞抗体消耗红细胞。
   3. 离心和重新悬浮细胞在10毫升完全 RPMI (10% FCS, 1% l-谷氨酰胺, 1% 青霉素, 1% 链霉素, 和50μ m 2-我)。

10. I-A^b聚丙烯染色, 以确定抗原特异的 CD4⁺ t 细胞和细胞内细胞因子染色的频率, 以确定在免疫动物中释放细胞因子的抗原特异性 t 细胞的频率

1. 聚丙烯染色
   1. 用 PE 共轭 I-A^b-卵子_323-339控制和免疫小鼠 (~ 20 x 10⁶细胞) 脾染色体 (1/12.5 稀释) 为1小时, 在37° c 在装订缓冲器 (PBS 与 2% FCS 和0.1% 南₃)。
   2. 添加 AF647 CD4 Ab (1:25) 和 7-反倾销 (检测死细胞), 以脾在室温下20分钟。
   3. 用流式细胞仪分析样品。
   4. 在 CD4 阳性区域获得50万事件, 以确定聚丙烯阳性事件的频率。
      注: 总脾是由 SSC/FSC 斑点杂交定义, 活细胞通过排除 7-反倾销阳性事件, 和 CD4 子集通过浇 AF647 阳性事件。
2. 抗原特异性细胞因子释放 T 细胞的频率
   1. 将大约 1 x 10⁷脾转换为4毫升的完全 RPMI 介质, 在六-井板中有或没有重组卵 (10 µg/毫升) 并孵育 16 h。
   2. 治疗细胞与 Brefeldin A (1:1, 000) 为另外的 5 h。
   3. 用 PBS 洗涤, 并受细胞内细胞因子染色, 如下所示:
      1. 在室温下为30分钟的 PE-CD8 或 PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 在装订缓冲器中) 染色细胞样品。
      2. 室温下4% 粉煤灰固定20分钟。
      3. Permeabilize 使用性解决方案, 根据制造商的指示。
      4. 用 AF647-conjugated 干扰素抗体 (1:50) 在室温下20分钟清洗细胞和标签。
      5. 洗涤细胞和受流式细胞仪分析如上文所述。

结果

采用上述一般程序, 研究了 BCG 表面法和替代抗原卵修饰的可行性。经改良的卡介苗的免疫原性被测试在体内。细菌表面易于标记的生物素快速显示素嵌合抗原没有任何可察觉的变化的细菌表型。通过抗原表达细胞有效地摄取了经过改良的卡介苗, 并能诱导小鼠的特定卵子免疫应答。

单体素融合质粒和蛋白质的生成...

讨论

我们在这项研究中报告了一种非遗传的方法快速有效地显示外源性蛋白在 BCG 表面, 以增加任何特定的抗原或特定的功能性质, 预期有效地提高细菌的免疫原性。我们证明, BCG 细胞表面可以很容易化的瞬时表面装饰与素融合蛋白。总的过程可以在2小时内完成, 而遗传转化和阳性克隆的选择需要2到3月的时间滞后。表面改性不影响细菌的生长和存活。用替代抗原卵细胞修饰的细菌能够将抗原传递到抗?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endotoxin-free RPMI 1640	StemCell Technologies	36750
Sulfo-NHS SS biotin	Thermo Fisher	21328
FITC-conjugated streptavidin	Sigma-Aldrich	S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer	MBL International	TS-M710-1
7-AAD	BD Pharmingen	559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin	Clontech	635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4	BD Bioscience	557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g	BD Bioscience	557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E	BD Bioscience	562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4	BD Bioscience	552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab	BD Bioscience	561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb	BD Bioscience	562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody	Thermo Fisher	31635
AF 647 rat anti-mouse CD4	BD Bioscience	557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG	Electron Microscopy Sciences	25100
Middlebrook 7H9 broth	BD Diagnostic Systems	271310
OADC	BD Diagnostic Systems	B11886
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines	American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid	Invitrogen	11803012
pUC57-OVA plasmid	GenScript	SD1176
BP clonase	Invitrogen	11789020
LR clonase	Invitrogen	11791043
pDONR221 plasmid	Invitrogen	12536017
Ni-NTA columns	Qiagen	31014
Pierce protein concentrators	Thermo Fisher	88527
Flurosave	Calbiochem-Novabiochem	345789
Axioplan II epifluorescence microscope	Carl Zeiss Inc
CCD digital camera	Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope	FEI Company	G2 200Kv
70μm Falcon cell strainer	Thermo Fisher	87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit	StemCell	18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody	BioLegend	116203
Brefeldin A	BD Pharmingen	555029
Cytofix/Cytoperm kit	BD Pharmingen	554714
Bright-Glo Luciferase assay system	Promega	e2620
Turner Biosystem luminometer	Promega	TD-20/20
Leica EM UC6 microtome	Leica Microsystems	UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer	Savant Instruments	NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials	Wheaton	VWR 66011-675