C57BL/6 小鼠自身免疫性神经炎的功能和病理评价的简易方法

摘要

本报告概述了一个简单的方法, 成功诱导实验性自身免疫神经炎 (一) 使用髓磷脂蛋白零 (P0)_180-199肽结合弗氏的完整佐剂和百日咳毒素。我们提出了一个复杂的范例, 能够准确地评估在这一过程中出现的功能性赤字和神经病的程度。

摘要

实验性自身免疫神经炎 (欢迎) 是自身免疫性外周脱髓鞘疾病的实验模型。通过免疫小鼠的神经源性多肽诱导炎症, 使其对周围神经系统的成分有直接的攻击作用。最近的进展使得在相对耐药的 C57BL/6 小鼠线使用髓鞘蛋白零 (P0)_106-125或 P0 的_180-199多肽在佐剂和注射百日咳毒素的结合。在 C57BL/6 菌株中诱导药物的能力允许使用在这个老鼠背景上存在的众多的基因工具, 从而允许对疾病的发病机制和对新疗法的机械作用的审讯的复杂研究与转基因方法相结合。在本研究中, 我们展示了一个简单的方法, 成功地诱导使用 P0_180-199肽的 C57BL/6 小鼠。我们还概述了在这个模型中出现的功能缺陷评估的一个协议, 同时还有一系列的病理特征。因此, 该模型是研究人外周脱髓鞘神经病的一个强有力的实验模型, 并确定了旨在促进髓鞘修复和预防自身免疫性神经损伤的潜在疗法的疗效。炎.

引言

外周神经病可以是遗传的起源或后天, 与后天神经病有代谢, 缺血性, 炎症, 或毒性沉淀。这些疾病也可以被归类为轴突或鞘的来源。最常见的后天性脱髓鞘外周神经病是急性炎症性脱髓鞘神经病 (AIDP, 也称为格林-巴利综合征, GBS) 和慢性炎症性脱髓鞘神经病 (CIDP)^1,2,3,4;两者都是 pathogenetically 的特点是对髓鞘的自身免疫反应, 导致鞘周围神经。在这些疾病中, 活化的 T 细胞穿过血神经屏障, 在三七皂苷内产生免疫反应。激活的巨噬细胞, 然后导致鞘要么直接通过吞噬的攻击或间接通过分泌炎症介质, 导致临床残疾, 如麻痹和感觉障碍⁵。虽然鞘轴突保留 remyelinated 跟随鞘的能力, 髓通常是延迟或不完整的, 导致裸轴突的易感性到不可逆转的损害, 这是永久临床的主要原因残疾.目前, 最有效的治疗方法是免疫调节, 但尽管他们的疗效, 在许多情况下, 恢复往往是缓慢的和〜25% 患者将体验到剩余的功能赤字, 大大降低他们的生活质量^{6, 7}。

是一种广泛使用的脱髓鞘周围神经病的动物模型, 它提供了有价值的洞察机制和评估新的治疗药物的方法⁴。该模型可诱导不同种类的家兔、大鼠、小鼠和豚鼠, 并由神经源性抗原免疫诱发。然而, 最终成功的细胞诱导依赖于适当的免疫反应的疾病发生。鉴于免疫功能的种类 (和间/应变) 的变化, 多种抗原和佐剂的组合已被开发成功地诱导了。在小鼠遗传工具方面, C57BL/6 是最广泛使用的;然而, 传统的 P2 蛋白肽 57-81 (P2_57-81), 导致在易感 SJL 小鼠菌株的疾病⁸是不能非法发病导致功能性赤字的 C57BL/6 菌株。幸运的是, 使用 P0_106-125或 P0_180-199多肽的敏化范例, 连同注射百日咳毒素的佐剂一起提供, 可以克服这一障碍, 使复杂的遗传工具能够用于小鼠模型。

本文介绍了一种简单的 C57BL/6 小鼠的诱导方法。此外, 还提供了一个综合详细的方法来评估与疾病相关的功能和病理的缺陷。P0_180-199多肽⁹首选于 P0_57-81备选¹⁰。与 P0_57-81备选¹⁰相比, P0_180-199模型已被描述为产生较不严重的临床症状, 因此可能会承受引入潜在有害的遗传摄动, 从外科手术中恢复 (如渗透泵植入), 并经得起跑步机的步态功能测试⁴。然而, 在 P0 的_57-81诱导变异中研究这种疾病时, 可以很容易地使用在这里描述的跑步机步态功能测试和组织学协议。

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研究方案

此处描述的所有程序均由弗洛里神经科学和精神健康研究所 (墨尔本脑中心) 动物伦理委员会批准, 并遵循澳大利亚的《使用动物科学守则》目的.

1. 可诱导性

注意: 在6-8 周的雄性 C57BL/6 小鼠中可以成功的诱导。归纳协议总共需要9天。0天指的是第一次免疫的那天。对于这个协议, 注射进行了麻醉和 #160;(见下面的步骤 1.1.2).

1. 在天-1:
   1. 准备百日咳毒素 (参见 材料表 ) 解决方案的1.6 和 #181; 使用无菌0.1 米小鼠-等渗磷酸盐缓冲盐水 (MT PBS)。
   2. 麻醉与异氟醚:
      1. 在麻醉室中放置鼠标 (C57BL/6、雄性、6-8 周), 并将氧气流量调整到1升/分.
      2. 打开异氟醚蒸发器, 调整它为麻醉 2.5%, 并监测呼吸和等待2分钟, 或直到初级反射 (角膜和后肢) 不再响应和 #160;
   3. 从麻醉腔中取出鼠标, 并管理250和 #181; 上述百日咳毒素溶液通过腹腔 (ip) 注射使用0.5 毫升注射器与 30 ^1/2 G 针.
   4. 准备注射接种免疫:
      1. 准备 解决方案 使用2毫克/毫升的 P0 _180-199 多肽解决方案 (带和 #62; 98% 纯度, 在0.9% 盐水中, 序列 s-s--r-g--r-Q-T-对-钒--l--s--M--d--s-秒--s.
      2. 准备 解决方案 B 使用20毫克/mL 解决方案 结核分枝杆菌 (见 材料表 ) 在弗氏和 #39; 完全佐剂 (包括: 15% mannide monoolate + 85% 的石蜡油和0.5 毫克/毫升干燥杀死和干的 M 分枝杆菌酸 ).
      3. 将最终接种用于注射, 将解决方案 a 和 B 的相等体积部分组合在一个磁珠搅拌器中, 并在室温下以最高速度混合1分钟.
         注: 解决方案 a 和 B 可以保存为库存, 并存储在4和 #176; C 为最多一个月, 但组合的最终接种必须在鼠标注射当天新鲜准备.
      在0天的
2. 中, 管理50和 #181; 接种 (步骤1.1.4 中概述) 的 L, 通过皮下注射使用23克针的皮下注射进入小鼠.
   注: 注射可以放在肩胛骨之间, 也可放在后肢和尾部之间.
3. 在1天, 使百日咳毒素溶液的1.2 和 #181; g/毫升 (在 MT PBS) 和管理250和 #181; L 通过 ip 注射使用0.5 毫升注射器与 30 ^1/2 g 针的一只老鼠.
4. 在3天, 重复上面的步骤 1.3.
   注: 库存解决方案 a 和 B 可以组成, 并存储在4和 #730; C 为最多一个月。然而, 最终注射接种, 生产的结合股票解决方案 a 和 B, 必须在当天进行注射.
5. 在8天, 管理50和 #181; 接种 (步骤1.1.4 中概述) 的 L, 通过皮下注射 (参见上面的步骤 1.2), 在与步骤 1.2 (每种动物) 相同的注射地点, 在同一注入的小鼠上.

2. 临床评分

1. 每天从0开始执行临床评分.
2. 根据已发布的条件为每个鼠标提供0、1、2、3或4的分数 ⁴ 。请参见 表 1 以了解临床评分.
   注意: 为了保持一致性, 应该努力在同一时间每天同时对小鼠进行评分.

3。电机功能评估

注意: 对相同队列的动物进行临床评分, 同时评估其运动性能。电机功能评估装置必须连接到装有步态功能成像系统的计算机 (参见 材料表 )。此外, 还建议所有被评估的小鼠都应该习惯于在诱导前进行的跑步任务。为此, 练习运行 (每只鼠标2测试运行) 在疾病诱导前三天执行 (天-3).

1. 打开马达功能评估设备并在指示灯按钮上切换.
2. 将鼠标牢牢地放在它的脚上, 然后将其放到一个装满红色墨水的容器中, 并保持其尾部的墨水.
   注意: 此步骤对于 C57BL/6 应变是必需的, 但如果使用白大褂颜色的鼠标应变, 则可以跳过.
3. 将鼠标放到步行车厢中, 并将跑步机速度设置为15厘米/秒.
4. 打开跑步机并单击 #34; 记录和 #34; 按钮以使用步态功能成像系统捕获鼠标的运行动作 (请参阅 材料表 ).
5. 使用计时器并测量每个运行三十六年代的时间。三十六年代以后, 停止记录和停止跑步机.
   注意: 无法成功完成三十六年代时间间隔的运行任务的鼠标被认为失败.
6. 将视频文件保存在指定的文件夹中.
7. 对每个要评估的鼠标重复上述步骤。每3天测试一次相同的运行任务的小鼠.
8. 使用软件为步态功能参数分析编辑过的视频文件 (请参阅 材料表 ).
   注: 有关如何分析不同的马达参数的详细信息, 请参阅制造商和 #39 的说明, 然后再进行分析。通过免疫组化或电子显微镜获得轴突和髓鞘损伤的组织学证据, 动物组织可以根据研究的具体目的, 在任何阶段后运动功能评估中进行.

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结果

P0_180-199多肽诱导的 C57BL/6 小鼠, 导致一个单相疾病的临床评分开始从6天后第一次免疫 (dpi), 和最大评分严重性观察从 25 dpi, 然后从 40 dpi 的一些临床评分改善持续时间 (图 1)^4,9。在步态功能方面, 早在 6 dpi 时, 小鼠就开始在一个简单的跑步任务上失败, 35 dpi 小鼠几乎没有能力完成一个简单的跑步机运?...

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讨论

本报告概述了一个简单的方法, 诱导使用 P0_180-199多肽在 C57BL/6 小鼠, 使量化的关键病理和功能缺陷的小鼠的免疫诱导。不同的是, 这里所描述的归纳协议是使用麻醉, 而执行免疫注射。使用异氟醚麻醉, 大大提高了能力, 以确保总体积的接种被注入皮下在理想的位置, 最小的错误和压力的动物。

小鼠将开始显示疾病的临床症状从 6 dpi⁴使用这种方法的诱?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc