牛皮质骨脆性评估的划痕试验

摘要

本研究通过显微划痕试验, 评估了亚细层的牛皮质骨断裂韧性。这是一个原始的, 客观的, 严谨的, 和可重现的方法来探测宏观尺度下的断裂韧性。潜在的应用是研究骨质脆性的变化, 由于疾病, 如骨骼。

摘要

骨是一种复杂的分层材料, 具有五不同层次的组织。诸如衰老和骨质疏松等疾病等因素增加了骨骼的脆弱性, 使其容易骨折。由于社会经济对骨折的巨大影响, 我们需要有新的方法来评估每个等级的骨骼的力学性能。尽管在所有尺度下都可以探测到刚度和强度--纳米、微观、细观和宏观--断裂评估迄今仅限于宏观测试。这一局限性限制了我们对骨折的认识, 制约了实验室和临床研究的范围。在本研究中, 我们利用微划痕试验和非线性断裂力学相结合的方法, 从微观到细观长度尺度来考察骨的抗裂性。对牛皮质骨标本进行短纵向定位试验。建立了细致的实验方案, 并进行了大量 (102) 试验, 以评估皮质骨标本的断裂韧性, 同时核算与骨显微结构有关的异质性。

引言

在本研究中, 我们用一种新颖的微划痕技术 (^1、2、3、^{4, 测量从中尺度 (骨) 到微型 (层状) 的牛骨的断裂韧性, 5}。由于不同层次的结构成分和组织不同, 断裂过程包括裂纹萌生和裂纹扩展直接影响着骨的长度尺度。因此, 评估较小长度的骨骨折是至关重要的, 以产生对骨骼脆弱性的基本认识。一方面, 常规的测试, 如三点弯曲, 紧凑的张力, 和弯曲试验通常进行的牛股骨和胫骨骨折的表征在宏观尺度^{6,7, 8}. 另一方面, 为了测量显微尺度下的断裂韧性, 提出了硬度的压痕断裂.⁹。利用硬度的压进行微压痕产生径向裂纹。此外, 奥利弗法尔压断裂韧性的方法是使用一个尖锐的立方体角压¹⁰。

在上述压基断裂韧性研究中, 用观测器测量了由此产生的裂纹长度, 并用半经验模型计算了断裂韧性。然而, 这些方法是不可的, 主观的, 结果是高度依赖于观察者的技能, 由于需要测量的裂纹长度使用光学显微镜或扫描电子显微镜。此外, 在纳米级进行了划痕测试, 但基础数学模型不是基于物理的, 因为它没有考虑到由于裂缝和缺陷而导致的强度下降¹¹。因此, 存在一个知识缺口: 一种基于物理力学模型的微观层次断裂评价方法。这一知识的缺口, 通过先聚焦于猪标本⁵, 促使微划痕试验应用于致密骨。这项研究现已进一步扩展, 以了解牛皮质骨。

试样的两个不同方向是可能的: 纵向横向和短纵向。纵向横向对应于股骨纵轴线的断裂性质。而短的纵向对应于股骨纵轴的断裂特性⁵。在这项研究中, 我们对牛皮质骨进行了划痕测试, 以表征骨在短的纵向方向上的骨折阻力。

研究方案

注: 这里描述的协议, 遵循动物保育指南的伊利诺伊州机构动物护理和使用委员会。

1. 标本采购

1. 收集新鲜收获的牛股骨从美国农业部 (USDA) 认证屠宰场和运输他们在塑料空气紧密袋在一个冷却器。
   注意: 在这里进行的研究中, 股骨是从 24-30 月大的动物那里采集的, 玉米喂养的, 体重约 1000-1100 磅。
2. 将股骨冻结在-20 ° c, 直到试样准备过程开始。此温度保持股骨新的^12、13、14。

2. 切割、清洗和嵌入试样

1. 在室温下, 将冷冻的股骨在一个容器中, 用水解冻约2小时。
2. 从中部骨干区域切割多张约 10-15 毫米厚的圆盘, 使用表顶金刚石带锯生产具有均匀横截面积皮质骨的标本。
3. 使用解剖试剂盒去除皮质骨上的任何软组织或肉。
4. 切割在步骤2.2 中获得的股骨的横截面, 使用菱形切片刀片, 在湿条件下沿骨骼的纵轴进行低速锯, 以获得多个大致立方剖面。
   注: 在这里, 仅对短-纵试样进行试样制备和划痕试验。但是, 除切削方向外, 其制备方法在横向方向上仍保持不变。
5. 用1.5% 阴离子清洗剂和5% 漂白水在超声波清洗机中用20分钟的时间清洗样品。
6. 将皮质骨标本嵌入丙烯酸树脂 (聚甲基丙烯酸酯 (PMMA)) 中, 便于操作和稳定。
   1. 要嵌入试样, 首先要在模具的壁上涂上脱模剂。然后在烧杯中混合丙烯酸树脂和固化剂, 按照 PMMA 制造商的指示。
   2. 将其中一个切口皮质骨标本放入每个模子中, 表面被划伤朝下。将丙烯酸树脂混合物倒入这些准备好的标本夹中。让标本固化的时间长达 4-5 小时。
7. 将嵌入的标本切成5毫米厚的圆盘, 露出表面被划伤, 使用低速锯, 然后将试样安装到直径 34 mm 和高 5 mm 的金属 (铝) 圆盘上, 使用氰粘合剂。
8. 将标本包裹在汉克斯平衡盐水溶液 (HBSS) 中, 在4° c 下冷藏, 直到进一步使用¹⁵¹⁶。

3. 研磨和抛光协议

注: 在小长度刻度上进行高精度测试的先决条件是平滑和平整的试样表面。以前的抛光协议^13,17导致表面粗糙度很大, 导致测量的误差较大。挑战在于在大面积 3 x 8 mm²表面上实现低平均表面粗糙度, 小于 100 nm。

1. 用400粒砂砾和600粒碳化硅纸分别在室温下研磨牛皮质骨标本1分钟和5分钟。保持磨床抛光机的基本速度为 100 rpm 和 150 rpm, 分别。
2. 机器研磨的牛皮质骨标本在室温下的800和1200的砂砾纸, 为期15分钟的每一步。保持磨床抛光机的基本速度为 150 rpm, 头速度为 60 rpm, 操作负载为1磅。
3. 用3µm、1µm 和0.25 µm 钻石悬浮液在硬、穿孔、无纺布上按相同顺序抛光, 室温下为90分钟。分别以 300 rpm 和 60 rpm 的抛光机的基座和头速度保持每步1磅的操作负载。
4. 使用0.05 µm 氧化铝悬浮液, 在柔软的人造人造丝布上抛光试样, 在1磅的时间内以 100 rpm 和 60 rpm 分别为90分钟, 也在室温下进行。
5. 将样品放在带有脱电离水的烧杯中, 将烧杯放入超声波浴中, 在研磨和抛光的每一步之间进行2分钟的清洗, 以清除残留物, 避免交叉污染。
6. 使用光学显微镜和 SEM 成像查看表面特征。
   注意: 如图 1所示, 牛皮质骨标本上观察到了骨、哈佛运河、水泥线、间质区和空隙。这些成像方法揭示了皮质骨标本的多孔、异质性和各向异性。此外, 对试样进行了先进的表面检查, 以评估抛光表面的质量。有代表性的抛光表面显示在图 2中。

4. 微划痕测试

注: 使用微划痕测试仪 (图 3) 对抛光的牛皮质骨标本进行微划痕试验。这项研究使用了一条尖端半径为200µm 的菱形罗克韦尔压和120的顶点角。该仪器允许应用线性渐进负载高达 30 N。此外, 该仪器还配备了高精度的传感器来测量水平载荷、穿透深度和由于划痕产生的声发射。该仪器可以捕捉划痕凹槽的全景图。

1. 在对皮质骨标本进行测试之前, 使用聚碳酸酯作为参考材料对洛克韦尔压尖端进行标定³。
2. 将皮质骨标本放置在舞台上, 并使用光学显微镜设置到微划痕测试器模块, 选择划痕试验部位。
3. 采用线性渐进载荷, 起始载荷为 30 mN, 结束载荷为 30 N。加载速率应设置为 60 N/分钟, 划痕长度为3毫米。
4. 在短的纵向 (图 3b) 上执行一系列的划痕测试, 如图 3所示的牛皮质骨标本。
5. 湿试样表面与 HBSS 后, 每组三至四的划痕测试, 以保持他们的水合。
6. 基于非线性断裂力学模型的划痕试验数据分析²。

结果

用原子力显微镜测量抛光表面的粗糙度。作为一个经验法则, 如果表面粗糙度是一个数量级小于感兴趣的表面特征, 那么试样就有资格作为一个抛光的。在这种情况下, 测量的表面粗糙度 60 nm 超过40µm x 40 µm 区域显然属于这个标准。

图 4显示了在短的纵向牛皮质骨标本上进行的典型划痕试验的力与穿透深?...

讨论

微划痕测试导致混合模式的断裂³。此外, 在短的纵向牛皮质骨标本, 骨折的过程是激活的探针挖更深。对于一个3毫米长的划痕, 探测到的棱柱体积大约是3600µm 长, 600 µm 宽, 480 µm 深。这一大体积有助于预测均匀反应。一个非线性断裂力学模型, 使我们能够提取的断裂阻力基于J-积分计算^1,2,4。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table Top Diamond Band Saw	McMaster Carr, Elmhurst, IL	Model  C-40	Blade speed of 40 mph; Blade dimensions: 37 inch in diameter, 0.02 inch wide and 0.14 inch deep
Buehler Isomet 5000 Precision Cutter	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	112780	Blade speed in the range of 200-5000 rpm in 50 rpm incrments; 8 inch diamond wafering blade
Branson 5800 Ultrasonic Cleanser	(Through) Grainger, Peoria, Illinois	39J365	Bransonic CPXH ultrasonic bath has a tank capacity of 2.5 gal
Buehler Ecomet 250 Grinder - Polisher	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	497250	8 inch base plate with a speed range from 10-500 rpm
Anton Paar, CSM Instruments Micro scratch tester	Anton Paar Switzerland AG	163251	Compact Platform, Acoutstic Emission Sensor
JEOL 6060LV general purpose scanning electron microscope	JEOL USA, Inc., Peabody, MA		Environmental scanning electron microscope which enables imaging at low vacuum levels.
Philips XL30 ESEM FEG	FEI Company		Wet mode working of the instrument enables imaging of non conductive samples without altering them
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Bovine Femur	L&M Slaughter house, Georgetown, IL		Corn fed, 24-30 month old mature bovine specimens.
Alconox Powdered Precision Cleaner	Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603	1104-1	Biodegradable, Non caustic, Interfering-residue free
Acrylic Plastic Casting	Electron Microscopy Sciences	24210-02	Polymethyl Methacrylate
CarbiMet SiC Abrasive Paper 400 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080400	Grinding - Abrasive Papers
CarbiMet SiC Abrasive Paper 600 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080600	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080800	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	16081200	Grinding - Abrasive Papers
Texmet P For 8'' Wheel PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407638	Polishing Cloth
8'' Microcloth PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407518	Polishing Cloth
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 3 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406631	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 1 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406630	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 0.25 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406629	Polishing suspension
MasterPrep Polishing Suspension, 0.05µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	40-6377-032	Polishing suspension
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025126	Buffer Solution