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  • 摘要
  • 引言
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  • 致谢
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摘要

我们在这里描述了一个简单和快速的方法, 以隔离的鼠伤寒沙门氏菌-含有吞噬从巨噬细胞涂层细菌与生物素和亲和。

摘要

鼠伤寒沙门氏菌是一种在人类中引起胃肠炎的兼胞内细菌。入侵后的叶片固有, S.鼠伤寒杆菌细菌被巨噬细胞快速检测和吞噬, 并被称为吞噬的囊泡, 以使其降解。隔离S.包含吞噬的沙门氏菌已被广泛用于研究S.沙门氏菌感染会改变体成熟的过程, 以防止细菌降解。采用蔗糖梯度离心法对含菌吞噬进行了分离。然而, 这个过程是费时的, 需要专门的设备和一定程度的灵巧。这里描述的是一个用于隔离 S 的简单而快速的方法.鼠伤寒-含有吞噬从巨噬细胞通过涂层细菌与生物素-亲和共轭磁珠。通过这种方法获得的吞噬可以悬浮在任何选择的缓冲液中, 使分离的吞噬的使用范围广泛, 如蛋白质、代谢物和脂质分析。总之, 此方法用于隔离S.含有吞噬的鼠伤寒杆菌是特定的、高效的、快速的, 需要最少的设备, 并且比传统的蔗糖梯度离心方法更具通用性。

引言

巨噬细胞是循环的专门的吞噬干细胞, 可以检测、吞噬和降解外周组织中的任何外来微粒, 从凋亡细胞到入侵微生物, 如细菌。表面受体介导的病原体特异标记物的识别通常存在于微生物的表面 (称为病原体相关的分子模式或 PAMPs), 巨噬细胞启动一个复杂的细胞膜重组为了包围和吞噬病原体1。

吞噬的病原体然后被巨噬细胞所包含的细胞内囊泡称为体。通过一系列的融合和裂变事件与其他囊泡, 如体和溶酶体, 包含体获得了一套蛋白质, 需要消除 phagosomal 的内容。因此, 体的酶组成在这个过程中是高度可变的, 被称为体成熟的2。

吞噬后不久, multimeric 复合泡 atp 酶 (v atp 酶) 被纳入体膜融合与体3。这个复合体利用 ATP 泵浦质子从胞到腔的体4。体的酸化是必要的为融合事件与其他泡5和为激活许多 pH 依赖性降解酵素6。在体膜上快速组装的另一种 multimeric 酶复合物是氧化酶 (NOX) 复合物。为了产生活性氧 (ROS) 分泌到体腔内, 并大大有助于杀死被吞噬的微生物7, 氮氧化物复合物氧化。

在成熟的初始步骤, 吞噬目前的标记通常如 Rab5 和 Rab7 的早期和晚期体分别与 v 型 atp 酶8的 v-0亚基。吞噬与溶酶体和晚期体的融合导致吞噬病原菌暴露于多种水解酵素, 如蛋白酶蛋白酶、脂肪酶和β-乳糖9。对这些酶的活化也需要管腔的酸化。例如, 蛋白酶 D 的裂解产生活性的短形式是 pH 依赖性的10。这些酶降解病原体, 并调解由巨噬细胞主要组织相容性复合物 (MHC) II 类分子向 T 细胞提出的病原体衍生短肽的产生, 以触发自适应免疫应答11。

因此, 体成熟对先天免疫反应至关重要, 并与免疫系统的先天和适应性武器联系在一起。这并不奇怪, 病原体已经进化的战略, 以克服由巨噬细胞通过上述的体成熟的过程。例如, 胞内细菌结核分枝杆菌和军团肺通过抑制 v atp 酶的组装和相应的流明酸化, 防止体成熟,12,13.其他细菌如李斯特菌或志贺氏杆菌福氏诱导体膜中的孔隙形成, 以逃逸到胞14,15。另一方面,沙门氏菌 enterica螺旋体鼠伤寒杆菌 (S。沙门氏菌)能够修改液泡内体的属性, 将其转换为其复制16的合适位置。此功能使S.沙门氏菌是研究病原体介导的体成熟干预的一个非常有趣的模型。

S. 鼠伤寒是一种在人类中引起胃肠炎的兼胞内细菌。在侵入固有后, S.鼠伤寒杆菌快速检测和吞噬的巨噬细胞, 并包含在吞噬17。一些报告以前曾描述过S.沙门氏菌-包含吞噬目前的制造商为体和溶酶体18, 和其他研究发现体-溶融合阻止后, S.鼠伤寒病毒感染19。

最初, 体成熟于S.用免疫荧光显微镜对鼠伤寒杆菌感染进行了研究。在分离细菌的吞噬技术的发展使更准确的研究体的内容, 从 endosome 和溶标记。迄今为止, 用于分离细菌的吞噬的主要方法是蔗糖梯度的亚细胞分馏18,20。然而, 这种方法需要多个离心步骤, 可以造成机械损伤的吞噬, 可能会影响稳定的 phagosomal 组分 (蛋白质和血脂), 是费时。此外, 它还需要使用 ultracentrifuge: 一个专门的设备, 这是无法进入每个实验室。

最近, 一种新的方法已被用于分离细菌含有吞噬, 其中细菌病原体被标记为化 lipopetide (Lipobiotin), 后来提取使用亲和共轭磁珠21.我们提出了一种替代的补充方法, 标记细菌表面胺类大分子与 NHS-生物素后, 亲和共轭磁珠。该方法获得的吞噬在 endosome 和溶标记物中具有很高的丰富性, 可用于多种测定, 从蛋白质分析到学分析。此外, 它不需要专门的设备, 如超速。此外, 通过消除离心步骤, 吞噬的机械损伤和使用的时间都大大减少。这种方法可以很容易地适应隔离的吞噬含有其他细菌, 如革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌, 也包括在这份手稿。总之, 此方法用于隔离S.含有吞噬的鼠伤寒杆菌是一种简单、cost-effective 且耗时较传统的蔗糖梯度分离法, 离心, 呈现高浓度的含菌吞噬。

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研究方案

所有涉及使用致病性的步骤 . 沙门氏菌 必须在 BSL-2 或更高的生物安全级别设施中进行。 S 的区域性和涂层 鼠伤寒, 以及骨髓源性巨噬细胞 (BMDMs) 的感染必须在层流罩下进行, 以防止污染。 S 的隔离含有吞噬的 鼠伤寒杆菌 可在任何 BSL-2 实验室的工作台上执行.

从小鼠体内提取骨髓, 将其分化成巨噬细胞, 是按照动物福利机构指南进行的, 并由北莱茵-伐国家自然机构批准,环境和消费者保护 [Landesamt f 和 #252; r Natur、Umwelt 和 Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen;文件编号: 84-02.05.40.14.082 和 84-02.04.2015. A443] 和科隆大学.

1. 培养 鼠伤寒杆菌

  1. 接种 沙门氏菌 (SL1344 菌株) 从一个单一的细菌菌落到5毫升的脑心灌注 (BHI) 汤使用细菌循环.
  2. 在37和 #176 的孵化箱中孵育细菌悬浮液; C. 一整夜摇晃.
  3. 在第二天, 将1毫升的细菌悬浮液转化为19毫升的 BHI 汤, 在圆锥烧瓶中孵育, 在37和 #176; C 在带震动的孵化器中.
  4. 监视 S. 用分光光度计测量 600 nm (od 600 ) 的光学密度 (od), 以 鼠伤寒杆菌 生长。大约每30分钟测量一次.
  5. OD 600 达到1.0 时, 从孵化箱中取出细菌悬浮液并将其转移到50毫升管中。离心机细菌在 5400 x g 为15分钟在4和 #176; C.
  6. 在10毫升无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 中去除上清和重.
  7. 5400 x g 离心15分钟在4和 #176; C.
  8. 去除上清液, 重4.9 毫升无菌 PBS 中的细菌.

2。用琥珀酰亚胺-生物素/亲和-共轭磁珠的 S. 鼠伤寒杆菌涂层

  1. 添加100和 #181; L 10 毫克/毫升生物素连接解决方案 (nhs-生物素溶解在二甲基亚砜) 新鲜制备的细菌悬浮在上一步中准备。例如, 将5毫克的 NHS-生物素稀释为0.5 毫升的无菌亚砜。正确混合移多次.
  2. 将混合料分成五1.5 毫升的管子.
  3. 在室温 (RT) 的 thermoblock 上孵育2小时, 并在 350 rpm 时持续晃动.
  4. 在 RT 中离心管在 1.5万 x g 处10分钟并丢弃上清液.
  5. 重在1毫升的无菌 PBS, 离心在 1.5万 x g 10 分钟的 RT 和丢弃上清.
  6. 重复步骤2.5 两次, 以完全删除多余的生物素链接解决方案.
  7. 最后一次洗涤后, 重1毫升的无菌 PBS 中的颗粒.
  8. 传输100和 #181; 10 毫克/毫升亲和共轭磁珠解决方案成1.5 毫升管, 并留在磁性机架上5分钟.
  9. 用吸管取出溶剂, 从磁性齿条上取下亲和共轭磁珠溶液, 并在步骤2.7 中重1毫升的生物素涂层-细菌悬浮液.
  10. 在 RT 上的 thermoblock 上孵育1小时, 持续晃动 350 rpm.
  11. 将解决方案放在磁性机架上; 等待5分钟, 然后用吸管移除不附着在墙上的细菌 (将其放在标签为和 #34 的试管中; 涂细菌和 #34;)。附着在与磁体接触的管壁上的分数是生物素/亲和涂层细菌.
  12. 从1毫升的无菌 PBS 中取出含有标签细菌的重.
  13. 将其再次放置在磁性机架上, 等待5分钟, 然后使用吸管移除 PBS.
  14. 重复步骤2.13 和2.14 两次, 以删除所有未涂有亲和共轭磁珠的细菌.
  15. 最后一次洗涤后, 重500和 #181 中的涂布细菌, 并将管状菌和 #34 贴上标签; 涂层细菌和 #34;.
  16. 计数和 #34 的菌落形成单位 (cfu); 涂细菌和 #34; 和 #34; 涂层细菌和 #34; BHI 琼脂板上电镀系列稀释的解决方案。大约 2 x 10 8 cfu/毫升的涂层细菌是从20毫升的初始细菌悬浮与 OD 600 1.0。将涂膜细菌悬浮液保持在4和 #176; C 在第二天用于感染巨噬细胞.

3。感染 BDMDs

  1. 在同一天, 当细菌被涂上生物素和亲和共轭磁性珠子时, 盘子完全分化 BMDMs 22 在6厘米的菜肴中密度为 5 x 10 6 细胞每道.
  2. 在第二天, 离心涂层细菌悬浮在 1.5万 x g 为5分钟在4和 #176; C.
  3. 在罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基中除去上清和重, 并辅以10% 胎牛血清 (FBS), 浓度为 10 x 10 6 cfu/毫升.
  4. 为了感染巨噬细胞在10的多样性, 去除培养基从 BMDMs 和增加5毫升涂层细菌悬浮准备。最佳的教学语言可以评估每一个细胞类型或实验目的的孤立吞噬.
  5. 在 RT 孵育10分钟以同步吞噬.
  6. 孵育在37和 #176; C 在 5% CO 2 孵化器为30分钟开始吞噬。其他细胞类型可能需要不同的孵化时间, 以确保细菌内部化.
  7. 从盘子中取出含有细菌的培养基, 用 RPMI 三次清洗细胞, 去除 non-internalized 细菌.
  8. 最后添加10毫升的 RPMI, 包含 10% FBS 和 50 #181; 庆大霉素杀死任何 non-phagocytized 细菌.
  9. 在37和 #176 中孵育感染的 BMDMs; C 与 5% CO 2 直到所需的时间点。所需的时间点必须根据所用的细菌和细胞类型和分析目的进行实验确定。为研究早期体-endosome 融合事件在 S. 沙门氏菌感染的 BMDMs, 30 分钟孵化建议。对于以后的事件的分析, 吞噬可以提取后2小时或 4 h 的孵化。长时间的巨噬细胞孵育与 S. 超过 24 h 的鼠伤寒导致巨噬细胞死亡。在体提取前扩大细胞内感染可能导致生物素分子的降解。然而, 我们并没有观察到24小时前涂层细菌中生物素的损失.

4。隔离 S. 沙门氏菌 -包含吞噬

  1. 准备所需的体隔离缓冲区 A (50 毫米管道, pH 值 7, 50 毫米氯化镁 2 , 5 mm EGTA), 加入糖 (德勤), 以最终浓度1毫米, 素 B 为最终10和 #181; M, 蛋白酶和磷酸酶抑制剂的浓度, 由制造商推荐.
    注: 必须在使用前立即将素 B 添加到体隔离缓冲区 a 中。素 B 扰乱细胞骨架, 促进细胞膜破裂.
  2. 在所需的时间点, 从受感染的细胞中取出培养基, 用不育的 PBS 加热到 RT.
  3. 添加750和 #181; phagosome 隔离缓冲每道菜, 在冰上孵育20分钟。在使用不同的单元格号时, 应按比例调整隔离缓冲区 A 的音量.
  4. 添加250和 #181; 体隔离缓冲器 B (50 毫米管, pH 7, 50 毫米氯化镁 2 , 5 毫米 EGTA, 220 毫米甘露醇, 和68毫米蔗糖)。岩石的板块, 以确保缓冲区达到整个表面的菜。在使用不同的单元格号时, 应按比例调整隔离缓冲区 B 的音量.
  5. 通过使用橡皮警察轻轻地刮掉盘子里的细胞, 然后把它们转移到 pre-chilled 1.5 毫升的管子上.
  6. 通过26G 针通过1毫升注射器至少15次 (一个愿望加上一个弹射的细胞悬浮计数作为一次) 的细胞悬浮。这足以释放 BMDMs 的胞浆含量。通过针的次数必须针对每个单元格类型进行优化.
  7. 将电池悬浮在磁性机架上, 等待5分钟。附着在磁体上的微粒是含有涂层的吞噬- S. 伤寒.悬浮液中含有其余的细胞成分.
  8. 将悬浮液转换为标记为和 #34 的1.5 毫升管; 胞和 #34;.
  9. 在1毫升的无菌 PBS 中, 从磁性机架上取下带有隔离吞噬的管, 并重它们.
  10. 将体悬浮在磁性机架上, 等待5分钟, 然后卸下 PBS.
  11. 重复步骤4.9 和4.10 以清洗隔离的 . 沙门氏菌 -包含吞噬.
  12. 最后删除 PBS 并重所需的缓冲区中的吞噬; 例如, 在 radioimmunoprecipitation 分析 (帕) 的缓冲液中进行蛋白质检测。大约50-200 和 #181; 根据本议定书的每个样本获得的蛋白质 g, 取决于细胞的初始数量和感染的莫伊.

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结果

通过本议定书隔离含有细菌的吞噬, 需要将细菌的法作为第一步。因此, 我们评估了S.的有效性鼠伤寒杆菌法通过共聚焦显微镜分析 BMDMs 感染化 mCherry-S。沙门氏菌标记为 Cy5-Streptavidin。简言之, BMDMs 在本协议中与 mCherry-S一起被感染。沙门氏菌先前化, 但不与亲和共轭磁珠一起孵育。在37° c 的30分钟孵育后, 细胞用温热的 pbs 洗涤, 用4% ?...

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讨论

用于隔离S的新方法本文介绍了用生物素和亲和-共轭磁珠吞噬细菌的方法. 在细胞膜的轻微破坏后, 含有细菌的吞噬可以很容易地用磁性齿条来提取。我们表明, 细菌的标记保留了病原体诱导炎症的能力, 不会改变宿主细胞的吞噬特性。重要的是, 这种方法获得的吞噬丰富的细菌和 endosome/溶标记和缺乏胞浆污染。

与传统的采用蔗糖梯度分离法的体分离方法相比, 该?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

在罗宾逊实验室的研究得到了来自科隆卓越集团的资助, 这是关于衰老相关疾病的细胞应激反应的支持, 德国科隆大学 (CECAD; 由 DFG 在德国联邦的卓越主动性之内资助和州政府) 和赠款从德意志 Forschungsgemeinschaft (SFB 670), 科隆财富和玛丽亚-Pesch 基金会的德国科隆大学。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
EZ-Link NHS BiotinThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
PIPESCarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SucroseCarl Roth4621.1
MannitolCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific1861280
Cytochalasin BSigmaC6762
DYNAL or DynaMag MagnetThermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 SpectrophotometerBio-Rad170-2501
Bacterial loop (10µl)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-streptavidinInvitrogenSA1011
anti-beta-actin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-47778
anti-mCherry antibodyThermo Fisher ScientificPA5-34974
anti-Rab5 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46692
anti-Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20943
anti-cathepsin D antibodySanta Cruz Biotechnologysc-6486
anti-Tomm20 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-17764
anti-calnexin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46669
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20357

参考文献

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