细菌附着在实验室测量的植物表面

摘要

本文介绍了一种简单的方法来测量和表征细菌对植物的黏附力, 特别是根和芽。

摘要

本手稿描述了一种方法, 以测量细菌结合无菌植物表面在光显微镜和通过使用可行的细胞计数。所用的植物材料包括根、芽、叶和切果。所描述的方法便宜, 容易, 适合小样本大小。在实验室中测量装订, 并可使用各种孵化介质和条件。可以确定抑制剂的作用。还可以评估促进和抑制绑定的情况。在某些情况下, 有可能区分各种条件是否会因其对植物或细菌的影响而改变约束力。

引言

在三种不同的情况下, 对植物表面的细菌结合的测量变得非常重要。第一种情况是检查人类病原体在植物表面的传播^1,2,3。这里的目标是防止细菌结合, 或清除或杀死绑定细菌, 从而减少疾病传播的植物材料。第二种情况是检查植物病原体对植物表面的约束力⁴。再次, 这里的目标是防止捆绑或删除或杀死绑定细菌, 从而减少疾病。第三种情况是对共生或植物生长促进细菌的结合的检查^5,6。这里的目标是促进细菌的结合, 从而提高植物的健康和作物产量。

本文所描述的对植物表面细菌结合的测量技术是廉价的, 相对容易进行。唯一的要求是显微镜和材料一般发现在细菌学实验室。对于一些技术, 浴 sonicator 是有用的。所描述的技术是为使用相对较小的样本尺寸进行的结合实验设计的。对装订的测量是在实验室中进行的, 尽管可能可以修改其中的一些技术用于温室或田间使用。

这些技术被用来测量细菌结合到根, 芽, 切叶, 切水果, 和完整的樱桃西红柿在实验室^{7,8,9,10,11, 12,13,14,15}。它们也被用来测量实验室¹⁶中生长在土壤或沙子中的植物的根系定植。该技术已应用于多种细菌种类, 包括农杆菌、根瘤菌苜蓿、大肠杆菌、沙门氏菌 enterica和铜绿假单胞菌荧光。在莫顿和福库 (2012)¹⁷中, 可以找到一个有用的描述方法来评估一个.在所有情况下, 所涉及的样本大小是小的, 一般少于 25-50 植物。所描述的技术适用于人类病原体, 需要在实验中加以保存。

研究方案

1. 无菌植物材料的制备

1. 准备在水中生长的幼苗。
   1. 在30、50、100或150毫升玻璃烧杯中放置少量种子 (少于 30)。我们已经使用了西红柿, 苜蓿,拟南芥, 豌豆, 豆类, 烟草, 生菜和胡萝卜种子的协议。
      注意: 要确定有多少种子可以在不污染的情况下在同一种子之间传播, 请参阅步骤1.1.2。
   2. 用80% 乙醇和漩涡简单地覆盖种子。让种子浸泡1分钟。
   3. 倒入乙醇和覆盖种子的解决方案, 50% 的体积商用漂白剂 (次氯酸钠) 和0.1% 海卫 X-100 在自来水。让种子浸泡20分钟。
      注: 如果种子大, 如豆类种子, 可能需要延长浸泡时间, 完全杀死种子表面的真菌。
   4. 倒入漂白剂混合物, 用无菌水洗涤种子3次。让种子浸泡在水中, 每洗1分钟。
   5. 为了获得无菌幼苗, 在5至25毫升之间添加少量的不育水, 这取决于种子的大小。将种子和水倒入不育的培养皿中, 种子萌发。
      注: 水应覆盖在盘子的底部, 但不覆盖种子, 以鼓励形成根毛。无菌描述一种只存在单一物种的文化。
   6. 在黑暗中孵化, 直到幼苗达到所需的大小之间的1厘米和10厘米 (约5天的西红柿和A. 芥和1至3天的苜蓿)。对于较大的种子, 使用覆盖的无菌容器, 容量超过100毫升, 如用箔覆盖的玻璃盘子。
2. 确定某种种子的污染频率, 微生物在表面灭菌后仍可在种子中或内部存活。
   注意: 这是必要的, 因为偶尔的种子携带的微生物下的种子大衣, 不能被杀死的表面灭菌。在种子中使用受污染种子的频率, 以确定有多少种子在同一时间内进行消毒, 而没有高风险的种子被污染, 由于一个种子与细菌或真菌, 生存的治疗。
   1. 通过1.1.3 执行1.1.1 步骤。
   2. 将种子放在营养琼脂培养皿上。在每道菜中放入大约10-30 粒种子, 使它们可以单独得分。用胶带或封口膜封住盘子。
   3. 孵化 3-5 天在25°c 每天评分为可见的产物微生物从种子。
3. 准备在沙子中生长的幼苗。幼苗可以在沙子中生长, 用于细菌黏附实验。
   1. 通过1.1.3 执行1.1.1 步骤。
   2. 在高压釜内杀菌石英或海砂。这两种材料都含有一些有机物质。如果这将影响实验, 洗涤沙子通过覆盖它与二次它的容量 0.1 M HCl. 混合10分钟, 允许沙子沉淀并倒出液体。用清水冲洗沙子3次, 一次用80% 乙醇, 然后用与0.1 米 HCl 相同的附加水冲洗两次. 消毒蒸压釜中的水洗砂。
   3. 将容器浸泡在50% 漂白剂中以5分钟的时间消毒, 用浸没的无菌水冲洗5次。允许他们用密封膜干燥和密封底部。从制造商那里获得的胶片一般不含微生物的内侧, 应该放置面对容器内。
   4. 将不育的沙子与足够的无菌水混合, 使沙子足够湿润, 使沙粘在一起。这笔钱将取决于沙子的干燥程度。通常 10-35% 沙子的容量是充足的。将湿沙子放在容器中, 允许足够的深度, 以满足需要的根长和足够的空间在沙子上的生长。确切的距离取决于使用的植物的种类和品种。
   5. 植物种子。
      1. 用不育的玻璃棒在沙子上做一个浅孔, 只要足够深, 就能把种子放在沙子的表面下面 (大约 1-5 毫米)。把种子放进洞里。用薄薄的一层沙子盖住它。用密封膜密封容器的顶部, 防止水的流失和额外微生物的进入。
      2. 在实验室的光照下或在温室中种植植物, 在适当的温度和日长的植物的种类和品种。对于西红柿, 苜蓿, 或拟南芥使用室温和12小时的光/暗循环。
   6. 植物幼苗在沙子的一个洞 (直径 1-2 毫米和足够深, 根将被沙子覆盖)。用无菌玻璃棒制造这个洞。如果需要, 用无菌的不锈钢钩针钩把根部小心地引导到洞中, 用沙子填满洞的两侧。
4. 或者, 种植植物 axenically 或在琼脂含有盐混合物, 如 MS 盐。使用直接生长在琼脂中的无菌植物的芽。避免在植物表面和细菌中以琼脂的根生长。这可能导致对植物表面细菌黏附的错误印象。

2. 其他植物材料的制备

1. 在温室内用清水冲洗植物材料, 以减少原微生物数量。植物上会有细菌和真菌。原生动物将存在于土壤中, 根上, 可能在树叶上。用漂白剂或乙醇洗涤会改变植物表面, 不推荐使用。
   1. 如果水洗了大量的微生物, 请用稀释的洗手液或稀释过氧化氢 (0.01%) 来处理植物, 以除去或杀死微生物。这对植物的损害一般比漂白剂或乙醇少。
2. 由于在当地市场购买的植物材料难以净化, 选择的材料似乎并不受长期贮存。避免部分材料出现褐色或损坏。
   1. 用清水冲洗, 并在使用前切过的材料的末端进行新的切割, 除非测试细菌与将在切割部位积聚的细菌 (和真核生物) 的相互作用是有意义的。不要用漂白剂或乙醇洗涤, 因为它们会改变植物表面。
3. 治疗伤口部位。伤口部位经常提供细菌进入植物的内部材料¹⁸。
   1. 阻止或减少细菌附着, 并通过, 伤口或切割的场所, 通过浸渍在熔融石蜡的切割边缘或通过油漆的网站用小刷子融化石蜡。不要使用刮刀或任何尖锐的实施, 因为这可能会损害组织。
   2. 在西红柿和石蜡等水果上密封茎痕。有些细菌会游入石蜡下的区域, 但它们的数量一般都很小。
   3. 如果细菌进入伤口部位是有兴趣的, 估计细菌可以移动的距离, 通过观察添加到溶液中的染料的运动来进行水流或扩散。标记运动细菌通过引入一个基因编码的荧光蛋白, 如绿色荧光蛋白 (GFP), 并跟踪他们使用荧光显微镜描述的步骤 6.1.2¹⁹。

3. 细菌的制备

1. 培养细菌。使用一种最接近细菌在实验室外的真实世界中遇到植物之前就可能接触到的条件的培养基。碳和氮源以及离子的存在, 特别是价阳离子 (钙, 镁, 铁, 锰, 锌) 和磷酸盐, 以及培养基的 pH 值是重要的。
   1. 使用极小的 AB 培养基或 Luria 汤作为一. 农杆菌和其他土壤细菌²⁰。对于大肠杆菌, 这可能源于肠道, 使用 Luria 汤。
   2. 添加诱导剂, 如根分泌物或商业植物萃取剂, 如 soytone 或糖, 如蔗糖或木糖, 以中等²¹。如果这些物质被用作诱导剂, 添加一个低浓度, 例如0.01%。如果他们使用碳源, 增加一个更高的浓度, 例如0.1%。
2. 准备细菌接种。在不育的水中或在将进行孵化的培养基中稀释细菌, 并将其添加到植物材料中。在步骤4.2 和4.3 中讨论了适当的稀释。
   1. 在使用细菌之前, 要去除培养基, 将细菌悬浮液在 1万 x g 处进行2分钟的分离, 然后将上清和并用重悬细菌涡流在同一种培养基中, 用植物材料进行孵化。这种方法可以去除或减少细胞外物质和附属物的数量或数量, 如多糖、胶囊、flagellae 和/或毛。如果这些表面结构保持完好, 那么在接种前先稀释细菌或使用步骤3.2.2 中描述的替代方法是很重要的。
   2. 作为一种替代的方法, 以去除生长培养基, 收集细菌的硝化棉或聚碳酸酯过滤器的孔隙大小为0.2 µm 或更少。用培养培养基冲洗细菌, 并在培养基中的无菌容器中, 通过温和摇动或涡流过滤器并用重悬。

4. 细菌的接种

1. 确定要接种的细菌数量, 参照测量结果确定细菌黏附力和潜伏期的长短。
2. 对于涉及潜伏期不到1天的微观研究, 接种的细菌数量相对较多。添加数量的文化, 以达到最终细菌浓度超过 10⁶细菌每毫升。为更长的孵化时间减少细菌接种大小。
3. 对于细菌黏附力将以可行细胞计数来测量的研究, 增加了一定数量的培养基, 以达到每毫升 10³到 10⁶细菌的最终细菌浓度。
4. 避免添加这么多的细菌, 他们的新陈代谢改变了孵化培养基中的 pH 值或氧浓度。用 ph 值纸或电极测量 ph 值。用氧电极测量氧气浓度。
5. 对于在沙子中生长的植物, 接种三种可能的方法。
   1. 在每毫升约 10⁶细菌的水中浸泡1分钟后, 在播种前将种子接种到细菌。
   2. 在1节中所述的发芽无菌苗接种根, 当幼苗根部长约1厘米, 或将整个幼苗放在水中每毫升 10⁶细菌的悬浮液中1分钟。
   3. 在种植前, 将细菌与沙子混合, 使其最终浓度达到每毫升约 10³细菌, 或者在播种后, 每毫升 10⁶细菌的悬浮液浇灌幼苗。

5. 细菌的孵化与植物材料

1. 在液体培养基中孵化细菌, 用植物材料在无菌水或蔗糖、矿物质盐或植物组织培养基 (如1:10 稀释 MS 盐)^22,23。
   1. 使用细菌不粘附的容器。尽量保持植物表面被淹没或温和搅拌。剧烈的搅拌可以防止粘附, 甚至去除植物表面的细菌。
   2. 在不同的时间间隔后观察光镜中的植物材料, 确定何时停止孵化并进行测量。粘附的时间过程通常是有价值的, 样品每1到4小时或每天都要根据相互作用的速度而定。
2. 要在沙子中孵化, 在步骤5.1 中应用与在液体培养基中孵化所描述的相同的注意事项。

6. 显微镜下附着力的测量

1. 用 Nomarski 或相对比光学进行显微测量, 以便于查看表面的细菌。然而, 任何有放大20X 或更高的亮场显微镜都可以使用。
   1. 使用显微观察, 以确定是否细菌是随机分布或位于特定的地点。还要检查它们是单独绑定还是在群集中。寻找 microcolonies 的存在, 提示细菌生长或粘连后的诱捕。检查细菌是否在表面形成生物膜。
      注: 生物膜是大量细菌附着于表面并被细胞外基质^23、24、25所包围。该结构可能是平滑和统一的, 或有一个更复杂的体系结构。研究了与植物表面相关的生物膜的方法¹⁷。
   2. 使用用荧光标记标记的细菌。如果存在其他细菌, 并且有兴趣的细菌被荧光标记 (如绿色荧光蛋白) 识别, 使用荧光显微镜来确定在其他细菌群中有标记细菌的存在²⁶。对于 GFP, 使用具有 490 nm 激发和 520 nm 发射的过滤器。
      1. 检查荧光标记是否对细菌有不良影响, 方法是观察同种混合的野生型细菌的无菌材料和使用 Nomarski 和荧光光学的同一菌株的标记细菌。如果荧光和暗细菌是随机混合和存在相同数量, 那么标签并没有干扰的化验。
2. 确定附着细菌的数量。
   注意: 很难确定显微镜中附着细菌的数量。当绑定到不规则的植物表面时, 一般不可能获得定量测量。扫描电子显微镜 (本文没有讨论) 可以用来做这样的测量。
   1. 当细菌被绑定到一个光滑的表面, 如根头发, 计数的细菌数量绑定到根头发的边缘每毫米根头发长度。在比较测量时, 注意使用大致相同大小和形状的根毛。
   2. 要确定显微镜中物体的大小, 请使用带有测量标记的商业幻灯片。观察并拍摄与实验材料使用的相同设置的幻灯片, 并使用生成的图像来确定显微照片中对象的大小。
3. 为显微镜准备样品。
   1. 清洗样品。将样品移到显微镜滑梯上的水滴或孵化培养基上, 并直接观察。
      注: 这有好处, 如果没有细菌生长或实际细菌死亡, 就不可能有很多免费的细菌。以无游离细菌为警告标志, 可能有细菌死亡或细菌结合的容器中进行孵化。洗涤样品的效果如图 1所示。
   2. 将样品轻轻地在水中或孵化培养基中放入一小瓶液体中, 轻轻地反转瓶子。然后将样品放在显微镜下的新鲜液体中进行观察。
   3. 使用普通的盖子滑动和显微镜幻灯片将样品装入液体中。
      1. 如果样品是厚的, 所以会在封面滑动下凸起, 使用按下的封面滑动。这些盖子滑动有一个橡胶或塑料环在盖子的边缘附近。将液体和样品放在井盖上, 然后将幻灯片放在顶部, 轻轻按下, 将盖子滑向幻灯片。反转和检查。
      2. 另外, 也可以用类似的方式来计算滑动和盖子滑动的藻类。请注意, 具有此深度的幻灯片一般不能用大于20X 放大倍数的物镜进行检查。

图 1: 为确定有无界细菌数量而准备样品的步骤.与番茄根毛 (a、B 和 C) 和尼龙螺纹 (D、E 和 F) 结合的农杆菌。在水中没有洗涤两个束缚细菌 (黑箭) 和游离细菌 (白色箭头) 的样品可以看到 (A 和 D)。洗涤后的束缚细菌仍然存在, 但游离细菌不再存在 (B 和 E)。超声波后, 从样品表面 (C 和 F) 去除了束缚细菌。请单击此处查看此图的较大版本.

4. 如果使用荧光细菌, 在去除沙子后检查显微镜中的样品。在沙子中生长的植物的根通常不适合显微镜, 因为沙子微粒干扰观察细菌。
   1. 按照步骤7从生长容器中移除该植物。将根放在水的容器中, 轻轻地混合, 除去将沉淀到容器底部的沙子。
   2. 从洗涤水中取出植物, 并将样品装入步骤6.3.3。

7. 使用可行细胞计数法测定附着力

1. 使用 sonicator 确定可用附着细菌的数量。
   1. 清除未绑定的细菌。将样品放在有足够水的瓶子里, 洗涤缓冲液或孵化培养基, 以覆盖植物材料, 并多次反转瓶子。
      1. 如果在最初的孵化中, 每毫升有超过 10³的游离细菌, 请执行顺序洗涤以清除它们。检查光显微镜 (见步骤 6.3) 以确定是否存在游离细菌。
      2. 清洗, 直到有大量的自由细菌数量减少, 但请记住, 有一个平衡的绑定和未绑定的细菌, 所以自由细菌的数量可能永远不会降到零。
   2. 用镊子或刮刀从洗涤液瓶中取出样品。
   3. 测定液体中植物孵化中的束缚细菌数量。
      1. 将洗涤过的样品悬浮在瓶子里, 用测量过的水、孵化介质或洗涤缓冲液覆盖。用足够的液体来覆盖样品。把瓶子放在浴缸里 sonicator, 油脂实验一分钟。
      2. 取出样品并在光镜下检查, 以确定是否已从植物中去除了束缚细菌。图 1显示了超声波样品中细菌的去除情况。如果仍然有被束缚的细菌存在继续 sonicating 样品直到这样时间, 没有束缚的细菌在样品表面保持。如果超声波不能去除束缚细菌, 加入 1-10 毫克/毫升无菌石英砂, 重复超声波和显微检查。
      3. 确定在步骤7.1.3.2 中看起来最有效的超声波过程不会降低细菌的生存能力, 方法是在溶液中悬浮细菌, 以用于超声波 (如果需要的话, 添加石英砂)。确定可行的细胞计数。油脂实验细菌并再次确定活细胞计数。
         注: 如果有效细胞计数减少, 通过改变液体和/或超声波时间的组成来修改过程, 直到治疗对存活细胞计数没有影响。
      4. 确定用于有效细胞计数的稀释缓冲器不影响在使用不同稀释缓冲器和/或水进行的可行细胞计数的条件下孵化的细菌的生存能力。
2. 使用均匀化方法确定活附细菌的数量。
   1. 将样品放在无菌砂浆或搅拌机或其它均匀化装置中。用测量过的无菌水、孵化培养基或洗涤缓冲液的容积覆盖²⁷。使用足以覆盖样本的卷。对于搅拌机使用100毫升。
   2. 研磨样品, 直到它是良好的匀质。在均匀化后检查 ph 值, 确保从植物组织中释放的酸没有导致 ph 值在7以下的急剧下降。如果 ph 值下降, 使用一个缓冲, 如磷酸盐缓冲在均匀化液中维持 ph 值。
   3. 确定可行的细胞计数。
3. 使用带有抗生素耐药性的细菌。
   1. 在存在多种类型细菌的情况下, 使用对抗生素的自发抗药性 (通常是利福平和萘啶酮酸) 标记细菌菌株。
      1. 确定使用抗生素的水平。如果其他有机体的文化在孵化中是可利用的, 板材这些文化在意欲的孵化的条件下生长与植物在包含选择的抗生素的一系列浓度的板材。确定不允许任何这些生物体生长的最低浓度。这是最低浓度的抗生素, 测试细菌将需要耐药性。
      2. 获得自发耐药性突变体。将丰富培养基中的细菌培养成晚期原木或固定相。0.1 毫升未稀释到一盘含有所需抗生素的适当浓度。确定要使用的浓度, 如步骤7.3.1.1 中所述。保持和净化生长的细菌, 从而对抗生素有抗药性。
      3. 通过在母体和耐药性菌株的液体培养基中做生长曲线, 确定抗生素耐药性不会降低细菌的生长。如果可能的话, 确定抗生素耐药性细菌与无菌植物材料的定植水平相同。
4. 确定在沙子中生长的植物所能存活的细菌数量。
   1. 从容器和沙子中取出植物。要从容器中移除植物, 首先要去除容器顶部和底部的密封材料。将容器放在一张不育的纸上, 轻轻地将容器轻轻地敲开, 以松开材料, 将整个沙子或泥土和植物作为一个大锥形圆筒。
      1. 如有必要, 使用刮刀或拉杆松开容器底部的边缘周围的材料。
   2. 当含有该植物的沙子或土壤的钢瓶在纸上自由时, 将其拆分为中间, 露出植物的根部。如果需要, 可以从容器的边缘和根部附近抽取沙子样品。这可能有助于确定细菌的传播 (和积累和增长)。
   3. 测量根的长度。拾起根和去除沙子和细菌黏附松散地对根 (根际材料) 通过浸洗根在被测量的水或缓冲的容量和轻轻地摇晃它。在合适的培养基如 Luria 琼脂上, 确定在产生悬浮液中细菌的存活细胞计数。这表示与根松散关联的细菌数量。
5. 通过超声波移除紧密绑定的细菌, 并确定它们的数量, 如步骤7.1 所述。
6. 另外, 要确定紧密结合的细菌根部的位置, 将洗涤的根放在含有营养琼脂或其他合适培养基的培养皿的表面上。使用解剖显微镜或放大镜观察3天后根部细菌菌落的位置。
7. 表达结果为每株细菌数量, 每厘米²的表面积, 每厘米根长度, 或每克新鲜重量的组织。在同一天进行多次复制, 同时使用不同的细菌培养和不同的植物材料在不同的日子进行复制。

8. 确定孵化条件对粘连的影响是由于细菌或植物的反应引起的。

1. 使用死的或被杀死的植物材料。
   1. 对植物材料进行各种化学、护或其他热处理等处理, 以杀死它。使用上述任何一种处理方法后, 在水和孵化介质中彻底清洗植物材料。然后接种细菌。这不会破坏植物表面, 但它会使它新陈代谢不活跃, 使它不能对细菌作出反应。
   2. 测量在步骤6和/或7中描述的细菌黏附力。还确定在孵化开始时用植物材料添加到孵化中的存活细胞数量, 以及在孵化结束时存在的存活细胞数量, 以确保在孵化过程中不存在有毒化学物质。
2. 使用无生命的材料。
   1. 使用细菌附着在无生命的材料, 以确定是否对细菌附着植物材料的影响, 是由于对植物或细菌的影响。选择一个无生命的物质, 细菌结合, 这是类似的形状和大小的植物材料研究。可能包括所有类型的滤纸 (纤维素, 硝化棉, 玻璃纤维, 聚碳酸酯等), 螺纹 (尼龙, 棉花, 聚酯, 玻璃羊毛等), 玻璃或塑料盖玻片, 不锈钢券, 和透析膜。
   2. 在水中彻底清洗无生命物质, 在使用前将孵化的培养基进行消毒。在步进8.2.1 中列出的大部分材料都是稳定的热处理杀菌。
   3. 在所需的条件和分数下孵化无生命物质, 如步骤6和7所述。使用尼龙线的例子, 以确定在高钙浓度下的根毛的减少的束缚是由于 (至少部分) 的钙对细菌的影响, 如图 4²⁸所示。

结果

殖民根表面。为了确定纤维素的细菌生产是否在根系定植中起着重要作用, 研究了防止纤维素合成的细菌突变对¹⁶的影响。使用了步骤1.3 和7.1 中描述的技术。番茄种子在无菌水中进行表面杀菌和发芽。当根约2厘米长, 他们被浸泡在悬浮 10⁵细菌每毫升和种植在巴氏杀菌土中的容器。植物生长了14天在25°c 在 12 h light/12 h 黑暗的周期。在被表明的时间以后植物从容器被去除了。根被洗涤和微气泡在浴 sonicator 去除束缚的细菌。细菌数量是用可行的细胞计数来确定的。图 2显示了两种不同的纤维素-负突变对细菌对番茄根部的殖民能力的影响。虽然一些测量的标准偏差高达0.9 日志₁₀ (这类测量的一个共同问题), 但纤维素-负突变体的束缚的减少显然是明显的, 我们可以得出结论, 细菌生产的纤维素在番茄根系的定植中有助于细菌的生长。

图 2: 由野生类型和纤维素减去突变体的根癌.日志₁₀以野生a 型为基础的 C58 和纤维素-减去突变体 C58:1 和 C58:A60, 从番茄根中回收的每 cm 根长度细菌总数。显示的数字是从最少的四个单独实验的手段。条形表示方法的标准偏差。根接种了浸泡在 10⁵细菌每毫升一分钟的悬浮。这些植物是在容器中生长的, 而松散附着的细菌则是通过在玻璃瓶中洗涤缓冲液中的根部来去除的。紧密贴附的细菌被清除使用浴 sonicator 和由此产生的悬浮镀, 以确定可行的细胞计数¹⁶。此数字已从 Matthysse 和威廉·达拉戈·麦默恩修改。请单击此处查看此图的较大版本.

研究了多糖在大肠杆菌和其他细菌对苜蓿芽中的结合作用。由于大肠杆菌O157:H7, 一些腹泻病的暴发被追踪到受污染的苜蓿芽。用步骤1.1、5.1 和7.2 中描述的方法测量了无法使各种多糖的野生型细菌和突变体的结合。苜蓿芽在不育的水中以25摄氏度在黑暗中被消毒并发芽一天。四芽与附着的种子大衣被放置在无菌的塑料菜肴含有5毫升的水。在 Luria 汤中生长的细菌被添加到最后浓度约 5 x 10³每毫升。接种芽在25摄氏度在黑暗中孵化了3天。用马达驱动的聚四氟乙烯玻璃均质机在洗涤缓冲器中进行剧烈倒置和匀质, 在5毫升的无菌水中洗净豆芽两次。以前的实验中使用的细菌标记的质粒携带 GFP 基因显示没有内化细菌, 虽然表面细菌很容易观察到。结果见表 1。检查了两株大肠杆菌O157:H7。在这两种菌株中, poly-β-1,6-glucuronic 酸 (PGA) 的产生对致病性大肠杆菌对植物表面的束缚作用最大。结肠酸在装订中也起着重要作用。虽然纤维素-负突变体中的结合量的减少是显著的, 但它并不像其他两种多糖那么大。

多糖生产基因突变对大肠杆菌 O157:H7 与芽苗和开放种衣结合的影响
菌株	突变或基因型 (相关表型)	记录10每芽或种衣的细菌数量
		苜蓿芽b	打开种子大衣
86-24	无 (野生类型)	4.7 @ 0。6	5.6 @ 0。2
8624N	yhjN(纤维素-减去)	2.9 @ 0.7c	3.5 @ 0.6c
8624C	wcaD(结肠酸-减)	1.8 @ 0.7c	2.4 @ 0.5c
8624P	pgaC(PGA-减去)	< 1.0c	1.0 @ 1.0c
DEC4A	无 (野生类型)	5.6 @ 0。2	6.1 @ 0。3
DEC4AN	yhjN(纤维素-减去)	4.8 ~ 0.8d	4.1 ~ 0.8d
DEC4AC	wcaD(结肠酸-减)	3.9 @ 0.5c	4.8 ~ 0.8d
DEC4AP	pgaC(PGA-减去)	< 1.0c	1.2 @ 0.7c
一个平均的标准偏差至少三测量的数量 (日志10) 的细菌绑定3天后。
b 芽在测量前洗净。
c 显着不同于野生类型: P < 0.01。
d 显着不同于野生类型: P < 0.05。
此表已从 Matthysse、迪欧、Mishra 和托雷斯10进行了修改。

表 1: 多糖生产基因突变对其结合性的影响大肠杆菌 O157:H7 芽。为了确定各种多糖和脂多糖对苜蓿芽苗的致病性大肠杆菌O157:H7 菌株的作用, 对一组突变体对芽苗和开皮种衣的约束力进行了研究, 采用了方法步骤6中所述。结果表明, poly-ß-1, 6n-乙酰氨基葡萄糖 (PGA) 似乎是必不可少的绑定到芽, 并认为纤维素和 colanic 酸是必需的最大结合大肠杆菌O157。此表已从 Matthysse、迪欧、Mishra 和托雷斯¹⁰进行了修改。

为了确定 pga 的生产是否足以引起细菌对植物表面的结合, 采用克隆操纵编码的质粒 (pMM11) 将 pga 生产所需的基因引入到两种不同的细菌中, 这将不会通常可以绑定到西红柿根部¹⁰。农杆菌A1045 是野生型菌株 C58 的突变体, 不能使 cyclic-β-1,2 葡聚糖, 也不能与植物表面²⁹结合。在苜蓿上形成根结节的根瘤菌苜蓿1021 未与非豆科植物 (包括西红柿¹²) 结合。步骤1.1、5.1、6.3 和7.1 中描述的技术用于确定是否能够使 PGA 通常增加细菌对根表面的结合。番茄种子在无菌水中进行表面杀菌和发芽。根被切成1厘米长的段, 放在不育的水中, 细菌接种。由于这两种细菌以不同的速率生长, 所以在不同的时间对结合进行了测定, 以允许大致相等的细菌生长量。质粒 pMM11 的存在导致了两种物种的束缚细菌数量的相似显著增加 (表 2)¹⁰。在光镜中也看到了捆绑的显著增加, 但这两种物种的结合是非常不同的 (图 3)。 A1045 作为单个细菌被绑定到根表面。苜蓿在大团簇中, 只有少数细菌直接附着在根部, 大多数细菌附着在其他细菌上。这个例子表明, 简单的分析细菌的数量, 而不包括显微观察, 可以给一个误导的印象, 实验结果。虽然两种方法 (可行细胞计数和显微观察) 表明, pMM11 增加了对番茄根系的细菌结合, 但由 PGA 生产所造成的结合类型不同的两个细菌¹⁰。

质粒 pMM11 对番茄根系细菌结合的影响
菌株	质 粒	每毫米根长度的细菌数量
A1045 农杆菌	没有	0.25 x 103 @ 0.25 x 103
	pBBR1mcs (矢量)	0.25 x 103 @ 0.25 x 103
	pMM11 (PGA 合成)	10 x 103 @ 0.25 x 103
S. 苜蓿 1021b	没有	未检测到
	pBBR1mcs (矢量)	未检测到
	pMM11 (PGA 合成)	50 x 103 @ 5 x 103
2小时后测定细菌结合量
b. 18 小时后细菌结合量的测定
此表已从 Matthysse、迪欧、Mishra 和托雷斯10进行了修改。

表 2: 质粒携带基因对 PGA 合成的影响 A1045 和苜蓿 1021 到西红柿根段。为了研究 poly-ß-1, 6n-乙酰氨基葡萄糖 (PGA) 的能力, 以促进细菌对植物根系的结合, 一个质粒的影响, 使 PGA (pMM11) 的能力, 对两株植物相关细菌的结合, 以西红柿根被检查。在缺乏质粒或质粒存在的情况下, 两种细菌对番茄根部均无明显的约束力, 而不存在 PGA 合成 (pBBR1mcs) 的基因编码。加入 PGA 合成基因的质粒增加了两种细菌的结合。因为. ................. .........苜蓿后2小时的苜蓿结合量。所使用的技术是步骤7中描述的方法。此表已从 Matthysse、迪欧、Mishra 和托雷斯¹⁰进行了修改。

图 3: 质粒 pMM11 携带 PGA 生物合成基因对 A1045 和苜蓿1021 至番茄根毛的结合作用。对西红柿根毛的约束力) a.农杆菌 A1045, B) A1045 pMM11, C) s. 苜蓿1021 和 D) s. 苜蓿1021 pMM11。虽然两种细菌的结合度的增加大致相似, 但在光镜中看到的结合的细节却是截然不同的。所使用的技术是步骤6中描述的方法。此数字已从 Matthysse、迪欧、Mishra 和托雷斯¹⁰进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

有时可以使用绑定到非生物表面, 以帮助区分细菌和植物在特定的相互作用的贡献。单极多糖 (UPP) 已被证明能够调解细菌结合到各种生物和非生物表面³⁰。钙被观察, 以抑制约束的一个. 农杆菌的植物表面介导的 UPP²⁸。为了确定细菌结合对植物表面的钙离子的抑制是由于对细菌或在植物表面的作用, 细菌的捆绑对尼龙螺纹被审查了。使用了步骤8.2 中描述的技术。在步骤1中描述的番茄种子表面被杀菌, 在水中发芽。细菌生长在最小的培养基与蔗糖, 并添加到番茄根或尼龙线的最终浓度约 10⁵/毫升, 如步骤5.1 所述。显微镜观察了添加 CaCl₂对番茄根系和尼龙丝细菌结合的影响。图 4显示了类似的抑制钙结合使用任何表面表明, 钙的影响主要是在细菌¹⁰。

图 4: 钙对农杆菌结合对番茄根毛和尼龙丝的影响.在1:10 稀释 MS 盐和1:20 稀释 AB 最小培养基的情况下, 用西红柿根 (a 和 B) 或尼龙线 (C 和 D) 在24小时内培育了农杆菌; 0.4% 蔗糖 (A 和 C) 或1:10 稀释的 MS 盐和1:20 稀释的 AB 最小培养基, 0.4% 蔗糖含有60毫米 CaCl₂ (B 和 D)³¹。添加的 CaCl₂抑制细菌结合的根和尼龙线表明, 抑制主要是由于对细菌的影响, 而不是在植物表面。请单击此处查看此图的较大版本.

讨论

重要的是要知道所有的表面, 细菌可以坚持在实验中。因此, 如果能用玻璃管和吸管来完成可行的细胞计数, 就可以低估能够与玻璃结合的细菌。如果植物生长在琼脂或土壤中, 一些琼脂或土壤留在植物上, 那么细菌就会粘附在附着物上, 而不是植物。另一方面, 洗涤植物表面, 特别是在根的情况下, 可能去除天然表面涂层如粘液, 从而改变粘附试验的结果。

重要的是要确定, 添加到孵化混合物中的细菌在实验中仍然活着。因而可生存细胞计数自由并且附有的细菌应该通常被做。一些治疗或细菌突变可能会降低细菌的生长速度, 或者实际上导致部分细菌数量的死亡。除非使用特殊污渍, 否则活体和死细菌在显微镜下可能无法区分。有一个有用的染色试剂盒的活/死细菌, 这取决于排除染料的活菌。然而, 如果有混合的细菌种类的人口存在, 那么可行的细胞计数的兴趣物种可能是最简单的方法来确定孵化是否导致细菌死亡。

培养基组成会影响细菌的生存和生长。根渗出物和从伤口和切割部位释放的物质将提供基质以支持适度的细菌生长。在这些条件下, 磷酸盐、氮和铁往往会受到限制。价阳离子如钙和镁可能影响黏附力。在某些情况下, 碳源会影响粘附。pH 值也很重要。一般来说, 根际的 pH 值介于5.5 和6.5 之间。

必须小心使用有抗生素耐药性的细菌。最常用的抗生素是利福平和萘啶酮酸。对这些抗生素的抗药性通常是由于染色体基因 (RNA 聚合酶和回旋酶) 的突变, 因此在孵化过程中不易转移到另一株。这种耐药性也不会导致抗生素的降解或改性。除非质粒不能转移到任何其他细菌, 否则不推荐用质粒传播的基因标记标记细菌。抗生素耐药性不应归因于抗生素的降解或化学改性, 因为抗生素敏感的细菌如果靠近耐药性细菌, 就能在抗生素板上生长。

本文所描述的方法对于小样本大小和/或实验中需要包含样本 (例如, 涉及人类病原体的实验) 非常有用。对于大样本大小 (超过100克的材料或超过50种植物), 其他方法或对这些方法的剧烈修改将需要^{10,19,32,19,33,34,35,36}. 除了正在研究的物种以外, 存在大量的微生物也会造成重大问题。可能的解决办法包括使用标记有荧光蛋白或耐药性的细菌, 如步骤6.1.2 和7.3 所述。然而, 当有兴趣的细菌是稀有的个体在大量的其他微生物中, 这些标记可能不足以允许对所研究的细菌数量进行明确的评估。

这里描述的所有方法都是基于实验室的方法。温室研究需要稍加修改。对于那些原生动物、昆虫和其他牲畜捕食和气候变化使实验条件的提供复杂化的实地研究, 可能需要进行更多的重大修改。在未来, 这些方法可以扩展到包括两个或更多的微生物在植物表面的相互作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
light microscope	any	N/A	phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.
seeds	any	N/A	make a note of the seed lot number and the cultivar
bleach	any	N/A
bath sonicator	any scientific supply company	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
nutrient agar	Difco	001-01-8
soytone	Difco	24360
Sand	sea sand Fisher Scientific	S25
sand	Sigma-Aldrich	S9887
conetainers	Stuewe & Sons, Inc.	Ray-Leach cone-tainers	many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow
parafilm	any scientific supply company	N/A
MS salts	Sigma-Aldrich	M5524
parrafin	any	N/A
centrigfuge	any scientific company	N/A	to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed
vortex mixer	any scientific company
micrometer	ACCU-SCOPE Accessories	A3145
Sedgwick-rafter counting cell	Hauser Scientific	HS3800
probe-clip press-seal incubatin chamber	Sigma-Aldrich	Z359483
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501
naladixic acid	Sigma-Aldrich	n8878
Live/dead stain	In Vitrogen Molecular Bioprobes	L7007