用活细胞显微镜研究低压等离子体灭菌对枯草芽孢杆菌孢子存活的不利影响

摘要

这项协议说明了评估在用低压等离子体处理后恢复枯草芽孢杆菌孢子后, 监测活力参数和 DNA 修复过程的相关性所需的重要连续步骤。荧光标记的 DNA 修复蛋白质通过时间分辨共焦显微镜和扫描电子显微镜。

摘要

等离子体灭菌是一种有前途的替代传统的杀菌方法的工业, 临床和航天的目的。低压等离子体 (LPP) 放电含有广泛的活性物种, 导致快速的微生物失活。为了研究 LPP 杀菌的效率和机制, 我们使用试验生物体的孢子枯草芽孢杆菌, 因为它们对常规灭菌程序的抵抗力非常高。我们描述了枯草芽孢杆菌的生产孢子单分子膜, 低压等离子体在双电感耦合等离子体反应器中的杀菌过程, 用扫描电子显微镜 (SEM) 表征孢子形态, 以及用活细胞显微镜分析孢子的萌发和生长。血浆物种的一个主要目标是基因组材料 (dna) 和修复的等离子体诱导 DNA 损伤孢子复活是至关重要的生存的有机体。在这里, 我们研究了孢子萌发能力和 dna 修复在孢子萌发和生长后 LPP 的作用, 通过跟踪荧光标记的 dna 修复蛋白 (RecA) 与时间分辨共聚焦荧光显微镜。经过治疗和未经处理的孢子单膜激活发芽和可视化的倒置共聚焦活细胞显微镜随时间的反应, 个别孢子。我们的观察表明, 萌发和超过孢子的分数取决于 LPP 的持续时间, 在120s 后达到最低限度. RecA-YFP (黄色荧光蛋白) 荧光检测仅在少数孢子和发展在所有超过细胞, LPP 处理孢子略有升高。此外, 从 LPP 处理的孢子中获得的一些植物性细菌在细胞质中呈上升趋势, 并趋于溶解。所描述的个体孢子分析方法可以作为研究孢子萌发和生长其他方面的典范。

引言

太空探索的一个主要目标是在太阳系的其他行星体和卫星上寻找生命形式和生物分子的特征。将地球起源的微生物或生物分子转移到重要的勘探领域, 对火星和欧罗巴¹等行星机构的生命探测任务的发展和完整性产生了特别的影响。1967年由空间研究委员会设立的《行星保护国际准则》对载人和机器人任务向其他行星、卫星、小行星和其他天体实施了严格的管制, 并对在发射前对航天器和关键硬件部件进行清洗和灭菌, 以消除对陆地微生物的污染, 防止天体的交叉污染²。在过去的十年中, 非热等离子体的应用在生物医学和营养学研究以及航天应用中得到了广泛的关注,^3,4,5。等离子体灭菌是一种有前途的替代传统的杀菌方法, 因为它提供了快速和有效的微生物失活⁶, 同时对敏感和热不稳定材料温和。等离子体放电含有活性剂的混合物, 如自由基、带电粒子、中性/激发原子、紫外线 (UV) 中的光子和真空紫外 (真空) 谱, 导致快速的微生物失活³。本研究采用双电感耦合低压等离子体产生的低压等离子体 (DICP) 源^7,8灭活枯草芽孢杆菌孢子在玻璃测试表面上分布。

家庭的革兰氏阳性菌Bacillaceae广泛分布在土壤、沉积物和空气的自然栖息地以及在不寻常的环境中, 如洁净室设施和国际空间站^{9,10 ,11}。最明显的特点,芽孢杆菌是能力形成高抗性休眠孢子 (以下简称孢子) 生存不利的条件, 如养分枯竭¹²。孢子通常比它们的营养细胞相对于各种处理和环境压力更具抵抗力, 包括热、紫外线、γ辐照、脱水、机械破坏和有毒化学物质, 如强氧化剂或pH 变化的试剂 (在参考文献^13,14), 因此是测试微生物失活方法效率的理想对象。由于基因组 DNA 是细菌的等离子体治疗的主要目标^15,16, 修复的血浆诱导的 dna 损伤 (如 dna 双链断裂) 孢子复活是至关重要的生存细菌^{13, 17}。

因此, 我们研究了孢子萌发能力和 dna 修复在孢子萌发和生长过程中的作用, 处理后的孢子与低压力氩等离子体的个别孢子和它们的表达荧光标记 dna 修复蛋白质 RecA 与时间分辨共焦荧光显微镜。我们给出了在单分子膜中制备枯草芽孢杆菌孢子的步骤说明, 以实现重现性试验结果, 用低压等离子体处理芽孢膜灭菌, 制备等离子体处理的孢子超微结构评价使用扫描电子显微镜 (SEM) 和现场细胞显微镜分析的个人孢子的水平与监测的活性 DNA 修复过程中发生的细胞内反应等离子体治疗。

研究方案

1.枯草芽孢杆菌孢子的生产和纯化

1. 为孢子生产, 转移各自的B. 枯草芽孢杆菌菌株的5毫升隔夜文化, 补充适当的抗生素, 到200毫升双强度液体谢弗产培养基 (每公升 16 g 营养素肉汤, 氯化钾 2 g, 0.5 g MgSO₄* 7 H₂O, 2 mL 1 M Ca (不₃)₂, 2 毫升 0.1 M MnCl₂ * 4 h₂O, 2 ml 1 mM FeSO₄, 2 ml 50% (w/v) 葡萄糖¹⁸), 并培养它与蓬勃发展的曝气在37° c 72 H 或直到 > 95% 的文化有孢子。使用以下菌株的孢子:枯草芽孢杆菌PY79 (野生类型) b. 枯草芽孢杆菌 PY79ΔrecA:: 新 (缺乏 DNA 修复蛋白 recA) B. 枯草杆菌PY79 recA -yfp:: 猫 (recA 与黄融合荧光蛋白 [YFP]¹⁹)。
2. 在50毫升的试管中用离心法收获孢子15分钟 3000 x g, 通过反复洗涤步骤 (最多15次) 净化样品, 使用无菌蒸馏的 H₂O, 并通过相衬显微镜检查纯度和发芽状态。确保孢子悬浮物由相明亮的孢子 ( & gt ; 99% ) 组成 , 没有营养细胞 ( 棒 ) , 发芽孢子 ( 黑色 / 灰色外观 ) 和细胞碎片 , 否则进一步的显微实验可以扰。清洗样品, 直到达到预期纯度。
3. 通过在 LB 琼脂上镀出50µL 的10倍稀释 (即: 使用30µL 样品 + 270 µL 无菌水进行1:10 稀释, 确定孢子滴度。采取30µL 从特别稀释到270µL H₂O 为1:100 稀释等等) 计算 CFU (殖民地形成单位) 和孵育板材在37° c 隔夜。CFU 测定后, 通过浓缩或稀释无菌水, 将样品调整到每毫升 10⁹孢子。

2. 气溶胶沉积的枯草芽孢杆菌孢子的样品制备

注意: 孢子的堆积和重叠可能导致在治疗过程中产生遮蔽效应, 最终导致假失活动力学。为了尽量减少这个问题, 用气溶胶沉积技术准备孢子样品²⁰。简要地, 控制高精确度二物质喷管与电子定时器调控液体吞吐量与压力的载体气体的流动 (这里 N₂)。使用氮气流量将注入的液体样品通过喷嘴出口分散。

1. 将样品载体以灭菌的显微幻灯片 (用于生存动力学) 或圆形25毫米片 (用于荧光跟踪 DNA 修复过程/cLSM; 共聚焦激光扫描显微镜) 置于电控气溶胶喷涂单元内与喷嘴对准。所用的孢子浓度需要达到百倍的最终浓度。
2. 将孢子培养的1毫升转移到喷嘴流体入口, 并在1.3 巴压力下启动 0.1 s 的喷涂过程。喷洒的孢子悬浮 (1 x 10⁷) 形成一层薄薄的薄膜, 在几秒钟内迅速干燥, 形成均匀分布的孢子单层。在室温下将处理过的样品载体储存在无菌容器中。

3. 低压等离子处理

1. 制备生物样品的等离子体处理系统, 在 5 Pa 用氩等离子体在 500 W 处操作系统, 5 分钟。这样, 系统中的所有曲面都将被清洗和预热。这减少了分子的黏附从环境空气, 即氮气, 氧气和水, 当排泄系统。在对系统进行预处理后, 在玻璃货架的帮助下, 将样品放在反应堆容器的中心, 并将其仔细地放在反应器内。
2. 使用至少三生物复制。关闭会议厅并在 2 Pa. 后疏散, 将过程气体填入会议厅。调节系统压力至 5 Pa。
3. 经过规定的工艺时间, 关闭电源和供气, 并仔细排气系统, 以防止从样品持有人吹样品。通风后, 取出样品并将样品放置在系统中的下一个参数中。对于非等离子处理的控制暴露样品到真空仅 (5 Pa) 在过程气体的存在等效于最长的应用的血浆时间。

4. 孢子存活的恢复和评价

1. 准备一份蒸压10% 聚乙烯醇 (PVA) 的溶液, 用大约500的µL 仔细地盖住样品托架, 并让它们风干 4 h. 用无菌钳将干燥的 PVA 层 (现在含有孢子样本) 剥离, 并将其转移到2毫升反应管。将1毫升无菌水加入试管, 通过涡流溶解 PVA 层。此过程导致孢子的 > 95% 的恢复, 不影响其萌发能力²¹。
2. 在96井板 (即270µL 无菌 H₂O + 30 µL 样品/前稀释) 中, 连续地稀释1:10 的无菌水中的样品。在性汤营养琼脂 (LB) 上每稀释50µL, 在夜间孵育37° c 的盘子, 并列举生长的菌落数量 (CFU)。

5. 活体细胞显微镜和 DNA 修复过程在萌发孢子中的追踪

1. 对于发芽实验, 准备一个1毫米厚的1.5% 磅琼脂垫, 煮沸700µL 培养基和吸管它成一个无菌显微镜培养皿。10分钟后, 切出一个8毫米 x 8 毫米 x 1 毫米磅琼脂垫与无菌手术刀和转移琼脂仔细在顶部的孢子单分子是休息在25毫米玻璃片。
   注意: 这一步对于个体孢子的可视化是至关重要的, 并允许跟随它们的反应, 对营养琼脂诱导的发芽激活。因此, LB 琼脂服务两个目的, (1) 固定的孢子在表面上, 避免孵育沿表面和光学焦点, 和 (2) 激活孢子发芽。
2. 用琼脂覆盖样品后, 用 63 x/1.3 平面物镜油浸泡物镜, 将玻璃片迅速转移到成像室, 并通过自动共焦激光扫描显微镜与倒置光学显微镜对样品进行显微观察。
3. 执行荧光成像 (YFP) 与激发波长 514 nm 和发射可以检测到520和 560 nm。
   1. 使用照片乘数 (透射光路) 之一在扫描模式下记录明亮的图像。
   2. 记录时间序列与激光功率为 2.6%, 并设置共焦孔径为5通风单位和在采样频率1帧每三十年代从 0 h 到 5 h, 根据实验。特别值得注意的是, 高剂量的单色激光照射在 514 nm 完全抑制发芽 (图 1A, B)。
4. 在整个成像过程中, 在加热阶段保持样品在37° c (环境空气湿度)。每个条件至少使用三生物复制。在孢子聚集的情况下, 多层孢子分布或尘埃粒子污染, 堵塞等离子体处理 ("阴影") 可能发生, 并使阴影孢子发芽 (图 1C, D)。

图 1: 等离子体处理的孢子共焦活细胞荧光显微镜观察到的潜在问题(A, B)高剂量单色 (514 nm) 激光照射对孢子萌发的抑制作用。(A) 概述 (3 x 3 缝合框架) 的枯草芽孢杆菌(LAS72, RecA-YFP) 孢子萌发后180分钟。中间的框架被暴露在三十年代间隔时间到高剂量的激光 (514 nm, 70% 激光功率), 而周围地区 (= 帧) 没有照亮 (光明场通道合并图像和 RecA YFP 荧光; 有序结构由使用35毫米成像盘子与印有500µm 网格).(B) 演示了一个4X 的放大视图, 它显示了光照和非光照区域之间的边界, 表明孢子暴露在高剂量的单色激光照射下没有发芽和生长, 而孢子非光照区域完全恢复到表达明亮 RecA-YFP 荧光 (绿色信号) 的植物细菌。(C, D)被污染的微粒或多层孢子 (箭头) 覆盖的孢子似乎可以通过等离子体处理来保护底层孢子免遭失活, 并允许它们的萌发和生长 ("遮蔽效应")。(C) 孢子在六十年代被等离子体处理, 在萌发后180分钟或在 (D) 中成像, 120s 和成像后240分钟.请单击此处查看此图的较大版本.

6. 扫描电子显微镜 (SEM)

1. 使用扫描电子显微镜, 提供有关等离子体处理孢子的表面形貌的超微结构信息, 与未经治疗的对照相比。用溅射涂布机在片上用金钯 (3 nm) 将干燥的孢子单层膜涂上。使用场发射扫描电子显微镜对样品进行成像, 在5伏加速度电压下操作, 包括镜头内二次电子探测器, 以揭示地形对比。

7. 数据分析

1. 确定孢子生存从商数 n/n₀, 其中 n 是平均 CFU 的处理样本和 n₀是平均 CFU 的未经治疗的真空控制。用氩等离子体处理孢子失活的时间函数 (秒)。将所有数据表示为平均值和标准偏差 (n = 3)。
2. 使用成像软件分析活细胞成像获得的图像。在实验开始时以及在4小时后, 对孢子萌发和超过在等离子体处理后的比例进行量化, 在代表性的框架中计数孢子。为了在孢子存活测定中的意义确定, 使用统计软件对方差分析进行单因素方差检验。P值 < 0.05 被视为具有统计学意义。

结果

等离子体处理的枯草芽孢杆菌孢子的存活

等离子体处理的枯草芽孢杆菌在本研究中使用的孢子显示, 随着等离子体处理时间的延长, 存活率下降 (图 2)。表达recA-基因的菌株的孢子 YFP 显示了类似于野生型菌株孢子的存活曲线, 表明基因修饰对细菌活力没有显著影响。与野生型菌株的孢子?...

讨论

使用低温、低压等离子体进行表面灭菌是一种很有前途的替代品, 例如用电离辐射、化学药品 (例如,₂O₂之类的气体进行处理) 和传统的灭菌程序环氧乙烷) 或干燥和潮湿的热量²³。一般的杀菌方法主要是提供有效的灭菌, 但已知会影响处理过的材料, 并对操作者构成潜在的风险。低压等离子体提供了一个快速和均匀的生物失活, 使用的成分, 如紫外线光子, 自由...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Two substance nozzle (model 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Tube connectors	Festo	n/a	G 1/8
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN Polyamid tube	Festo	558206	d = 6 mm
Glass slides	VWR	48300-026
Electric Timer 550-2-C	Gefran	F000074	220 V
attofluor cell chamber	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, round
MgSO4*7 H2O	Sigma Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	Sigma Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
Glucose	Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
Nutrient Broth (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
96-wellplate	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software)	Systat GmbH, Erkrath, Germany	n/a
Attofluor cell chamber	Invitrogen	A7816
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom	ibidi	81168