小鼠膈运动神经元逆行神经解剖学追踪的研究

摘要

本文描述了荧光共轭霍乱毒素亚单位β胸腔内分娩后小鼠膈运动神经元识别的一种协议。比较两种方法注射胸腔: 膈与经胸的方法。

摘要

膈运动神经元是由 C3 到 C6 水平的颈椎运动神经元。轴突投射到膈神经支配呼吸隔膜。在脊髓切片中, 膈运动神经元不能从其他运动神经元中识别出形态学或生物化学标准。我们提供描述的程序, 以可视化膈运动神经元细胞体的小鼠, 后胸腔注射霍乱毒素亚基β (CTB) 共轭荧光。该荧光神经解剖学示踪剂有能力被抓住在隔膜神经肌肉交界, 被携带 retrogradely 沿膈轴突和到达膈细胞体。比较了胸腔 CTB 分娩的两种方法: 膈与经胸注射。这两种方法都是成功的, 并导致了类似数量的 CTB 标记的膈运动神经元。总之, 这些技术可用于可视化或量化的膈运动神经元的各种实验研究, 如那些关注膈膈电路。

引言

本研究的目的是提出一种可靠的方法来识别膈运动神经元 (PhMN) 在小鼠脊髓部分。在胸腔内注射荧光神经解剖学示踪剂作为传递方法, 以达到膈肌神经的投射到膜片上, 并使用逆行运输沿膈轴突标记膈细胞体。本文介绍两种胸腔内分娩技术: 膈与胸肺。

膈运动神经元是脊髓中继细胞, 其轴突汇聚成膈神经, 最终支配膈肌。这些是较低的马达神经元接受吸气驱动从球呼吸中心和中继到隔膜神经肌肉连接 (NMJ)。PhMN 结构成两个马达柱, 一个为每个 hemicord, 运行沿中颈椎脊柱。在包括人类在内的大多数哺乳动物物种中, 膈电机列从 C3 级别扩展到 C6^1,2,3。我们和其他人已经证实, PhMN 集中在大鼠和小鼠脊髓的 C3-C5 水平^4,5,6,7,8。膈细胞的地形图分布不随机;在膈肌运动池 (C3) 的颅骨部分, 支配的运动神经元分布较密, 而支配脚部的运动神经元则更是尾鳍 (C5)⁹。此外, PhMN 在腹角灰质中有不同的聚集。在 C3 水平, 膈细胞的簇在侧向, 然后他们在一个延髓方向转移并且被发现 ventromedially 在最尾部水平^10,11。

考虑到他们在灵感中的重要作用, 准确地识别 PhMN 在健康的脊髓中是至关重要的, 但在病理条件下, 如退行性疾病或脊髓外伤损伤, 也应遵循他们的命运。由于 PhMN 与其他颈椎运动神经元的形态学不同, PhMN 的识别依赖于在初级呼吸系统中心 (⁸) 的水平, 或在隔膜 NMJ⁷或在膈神经⁴。追踪器由神经纤维占去并且运载到膈肌细胞身体在颈椎, 在那里它可以被视觉化使用直接或间接检测系统。逆行或顺示踪剂在商业上有广泛的共轭。值得注意的是, 每个追踪器都被赋予无、低或高的跨突触追踪能力。

在目前的研究中, 我们选择了霍乱毒素的β亚基 (CTB) 功能性与 Alexa 555 (从今以后称为 CTB-荧光) 作为荧光标签, 允许直接可视化 PhMN 的冰冻脊髓部分。CTB 通常被描述为 monosynaptic 示踪器, 尽管实验数据倾向于显示 transneuronal 通道¹²。CTB 有能力将苷 GM1 在神经末端的等离子膜上。CTB 是通过网格蛋白依赖或独立的机制内化, 并通过反式高尔基网络进入内质网, 在逆行的^时尚13, 14.内部化和逆行传输似乎依赖于肌动蛋白骨架^15、16以及微管网络¹⁷。

为了证明 CTB 作为逆行神经解剖学示踪贴标膜片-PhMN 电路的用处, CTB 荧光被交付 intrapleurally。CTB 使用两种技术进行管理: 第一个包括剖腹手术和多膈注射;第二个, 较少侵入, 使用了独特的经胸注射。四天后, 荧光标记的 PhMNs 从健康和 spinally 受伤 (C4) 动物的颈椎脊髓中定量。

研究方案

实验性议定书是按照欧洲共同体理事会动物实验指令 (2010/63/欧盟、86/609/欧洲经济共同体和 87-848/欧洲经济共同体) 进行的, 并得到了纳尔大学动物伦理委员会 (伦理项目 n°17-284) 的批准。).图 1描述了两种方法: 膈或经胸注射。在研究中使用雄性 C57bl/6J 小鼠 (n=18), 年龄从3个月到4月。

1. CTB 溶液的制备

1. 膈注射:
   1. 将 CTB 在无菌水中的能量溶解到浓度为 0.2% (w/v)。
   2. 负载7.5 µL 的 CTB 溶液 (0.2% 瓦特/v) 在无菌 10-µL 微量泵与附加33口径针 (钝或短斜角) 为每个鼠标。
2. 经胸注射:
   1. 将 CTB 在无菌水中的能量溶解到浓度为 0.1% (w/v)。
   2. 负载20µL CTB 溶液 (0.1% 瓦特/v) 在一个无菌 500-µL 胰岛素注射器与斜面27口径针为每只老鼠。
      注: 请务必使用蒸馏水和无菌水, 并适当溶解 CTB 粉。该解决方案可以保持一个月摄氏4摄氏度 (不要冻结)。沉淀可能在几天后形成。使用前用吸管将溶液带入室温, 并混合使用。

2. 胸腔注射前的准备工作

1. 使用高压釜或玻璃珠灭菌器, 在手术前消毒手术工具。准备一件干净的长凳做手术, 并处理手术工具。
   注意: 在手术过程中使用的任何材料都应该是无菌的。不能灭菌的仪器, 如微量泵, 应用消毒剂 (必泰) 擦拭, 或者只应使用一次性。外科医生应该在手术开始前用消毒剂 (洗必泰擦洗) 洗手。外科医生应该戴上无菌手套、面罩和干净的长袍。
2. 称量动物, 并管理适当的麻醉剂量: 腹腔注射麻醉鸡尾酒 (如氯胺酮100毫克/千克和甲苯噻嗪5毫克/千克)。
3. 捏脚趾和/或检查眼睑反射的损失, 以确定是否正确麻醉鼠标。应用兽医软膏保护角膜。
4. 仔细剃须腹部皮肤 (为膈程序) 或右胸皮肤 (经胸手术), 使用电剪。剃得好, 足够宽, 以防止头发进入手术领域。
5. 通过局部应用10% 碘溶液在剃毛地区确保无菌条件。用碘溶液擦洗手术部位, 小心地从中心部位擦洗到周围。
6. 在整个手术中使用恒温垫保持动物的体温。

3. 用膈方法进行胸腔注射

1. 将麻醉鼠标放在加热垫上仰卧位。将卷纱垫放在动物的脖子下。对于成年鼠标, 请使用0.5 英寸厚度的滚动纱布垫。把这个垫子贴到手术板上, 以免发生运动。
2. 使用手术刀刀片, 切割腹侧皮肤沿中线: 做一个切口从剑突过程到脐区域, 而伸展皮肤侧向与另一只手, 使皮肤绷紧。不要对刀片施加太多的压力, 以免损害底层器官。
3. 使用小剪刀, 小心地把皮肤从腹部肌肉的切口周围剥离。这个程序将有助于缝合的肌肉和皮肤分开的手术结束。
4. 用小剪刀进行剖腹手术。通过在脐的水平上执行一个纽扣切口打开腹腔。切割腹部肌肉沿白色线 ("linea") 由剑突过程。
5. 为了形象化的腹部表面的隔膜, 收回腹部肌肉使用商业或自制拉钩。
   注意: 这些拉钩可以由形状为 L 挂钩¹⁹的 midi 大小的回形针组成。
6. 伸展开腹的两侧, 并把拉钩到板凳大衣上。优化视野的光照, 使隔膜的腹面不再在半影中。最强大的照明设备为这个目的是一个 LED 灯与定向光束。
7. 一方面使用软镊子, 举起 xyphoid 阑尾, 拉下肝脏的侧面裂片 (图 2A)。另一方面使用小剪刀, 小心切断悬吊韧带, 不损害胆囊或隔膜 (图 2B)。
8. 一方面用软镊子, 举起 xyphoid 附录。另一方面抓住哈密尔顿注射器。目标三的注射地点在右 hemidiaphragm 分别覆盖胸骨, 内侧和脚区域 (图 3A, 插入图 3B)。
9. 由于膜片厚度约为0.37 毫米小鼠⁷, 插入针不超过1或2毫米超过隔膜片, 以防止肺部损害在呼吸期间。通过每个站点的右膜片 (图 4B) 提供2.5 µL 的 CTB 解决方案 (0.2% 瓦特/v)。不需要膜片的稳定。
10. 对三个同侧注射点 (图 1A) 重复此过程, 并为 PhMN 池的双向标记 contralaterally。
11. 闭合剖腹手术部位, 缝合腹部肌肉与可吸收4-0 缝合。使用被打断的针间距为3毫米, 主要皮肤闭合与9.0 毫米伤口剪辑。收紧主食, 以防止动物拔下主食。间隔约5毫米的空间钉。不要过度收紧伤口夹, 因为这会导致愈合受损。
12. 用蒸馏水清洁微型注射器, 防止堵塞。慢慢地起草和驱逐2-3 次。不要把空气抽进注射器。

4. 胸腔内注射用经胸法

注意: 此方法灵感来自⁴中描述的过程, 并适合于鼠标。

1. 在加热垫 (图 4A) 上, 将麻醉鼠标放在左侧压疮位置。
2. 用手动触诊 (图 4B) 识别肘部区域下的第六和第七根肋骨。
3. 当助手扩展右前-和后肢 (图 5A) 时, 插入注射器 cranially 定向和切下的第六或第七肋, 3 毫米深从皮肤, 与斜角向下 (图 1B和图 5B)。
4. 轻轻抬高针, 以确认, 通过解除肋骨, 它是很好地定位到胸腔 (图 5C, 插入图 1B)。
5. 用两个手指在胸壁上施加轻微的压力, 稳定胸部的呼吸运动。
6. 在拿着注射器的同时, 在单个注射中提供20µL 的 CTB 溶液 (0.1% 瓦特/v)。

5. 术后护理

1. 术后立即将鼠标放置在恒温垫上的右侧压疮位置, 以恢复。这确保了示踪剂传播在胸腔的右侧, 并允许监测动物的呼吸。
2. 管理1毫升无菌盐水溶液。提供后续注射, 如果动物出现脱水和/或无精打采。
3. 在手术后的头两天, 每天两次在术后0.1 毫克/公斤的丁丙诺啡, 以尽量减少任何潜在的疼痛。
   注: 许多机构建议对侵入性手术进行多模镇痛, 如这里所描述的剖腹手术。这可能包括使用非甾体抗炎 (NSAID) 药物和/或局部麻醉剂在切口部位。这些药物通常是在第一个切口之前提供的, 以减少出现的疼痛。
4. 每天监视动物直至安乐死。

结果

研究中包括雄性 C57bl/6J 小鼠 (n=18), 年龄从3个月到4月。在实验的0天, 8 只小鼠接受了单边 C4 挫伤, 右侧, 根据发布的协议^7,18。作为假手术, 10 只小鼠在 C4 顶部进行了椎板切除术, 无挫伤。3天, 根据上述两种不同的程序, 对 CTB 荧光胸腔注射的小鼠进行了准备。7天, 所有小鼠在麻醉后被安乐死 (氯胺酮100毫克/千克和甲苯噻嗪5毫克/千?...

讨论

本文所描述的协议可以适用于任何成年小鼠的应变或任何实验范式, 其中的 PhMN 电路的完整性应评估。例如, 肌萎缩侧索硬化 (ALS) 和颈脊髓损伤 (cSCI) 是与 PhMN 丢失、膈轴突顺变性和随后的呼吸折衷有关的条件。动物模型的 ALS 或 cSCI 模拟病理学和功能性呼吸衰竭观察到人类疾病。在这些模型中, 组织学技术经常被用来评估 PhMN 生存后, 针对 PhMN 神经保护^18,20

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm