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摘要

本手稿提出了一个详细的方法生成X-染色体臂探针和执行荧光原位杂交 (鱼), 以检查中期和中期我被捕的姐妹染色单体的内聚力状态果蝇卵母细胞。本协议适用于确定不同基因型的减数分裂手臂的内聚力是否完好或中断。

摘要

在人类中, 卵母细胞的染色体分离错误是导致大多数流产和先天缺陷的原因。此外, 随着妇女年龄的增长, 她们受孕体胎儿的风险急剧增加, 这种现象被称为孕产妇年龄效应。在减数分裂的过程中, 准确的染色体分离的一个要求是在卵母细胞经历的延长的前期阶段保持姐妹染色单体的内聚力。人类和模型生物体的细胞学证据表明, 在衰老过程中, 减数分裂的凝聚力会恶化。此外, 人类卵母细胞中的偏聚错误在减数分裂 I 中最为普遍, 与过早失去手臂的内聚力一致。模型生物体的使用对于解开依赖于年龄的丧失凝聚力的机制至关重要。果蝇为研究卵母细胞减数分裂凝聚的调节提供了一些优势。然而, 直到最近, 在不同基因型的卵母细胞或不同的实验条件下, 只有遗传试验才能检测到手臂的内聚力丧失。在这里, 提供了一个详细的协议, 使用荧光原位杂交 (fish) 直接可视化缺陷的手臂凝聚力在中期 i 和中期我逮捕了果蝇卵母细胞。通过生成一个鱼探针, hybridizes 到X染色体的远端臂并收集共焦 Z 栈, 研究人员可以在三维度中可视化单个鱼信号的数量, 并确定姊妹染色单体的手臂是否分离.这一过程使人们有可能在数以百计的果蝇卵母细胞中量化手臂的内聚力缺陷。因此, 这种方法提供了一个重要的工具, 以调查的机制, 促进凝聚力的维护, 以及导致其消亡的因素在老化过程中。

引言

在有丝分裂和减数分裂过程中适当的染色体分离需要建立、维护和以协调的方式释放姊妹染色单体的内聚力1,2。衔接是在 S 阶段建立的, 由内聚力复合体介导, 形成物理联系, 把姐妹染色在一起。在减数分裂, 衔接远端的交叉也功能举行重组同系物一起, 这个物理协会有助于确保正确定位的二价在中期 I 轴 (图 1)3,4, 5。在后期 I 释放手臂的内聚力允许同系物分离到相反的主轴杆。然而, 如果手臂的凝聚力过早丢失, 重组同系物将失去他们的物理连接和随机隔离, 这可能导致体配子 (图 1)。

在人类卵母细胞中, 染色体分离的错误是导致流产和先天缺陷的主要原因, 如唐氏综合症6, 其发病率随着产妇年龄的增加呈指数级的7。胎卵母细胞中建立了姊妹染色单体的内聚力, 在出生前完成减数分裂重组。卵母细胞, 然后在中期前逮捕我, 直到排卵和在此逮捕期间, 重组同系物的持续物理关联依赖于姐妹染色单体的内聚力。因此, 在减数分裂和正常妊娠结局中准确的分离需要五年的内聚力保持完好。

在人类卵母细胞长期减数分裂的过程中, 过早失去凝聚力已被建议为产妇年龄效应和多行证据支持这一假设8,9。然而, 考虑到研究人类卵母细胞减数分裂凝聚的挑战, 我们对这种现象的理解大多依赖于模型生物体的使用5,10,11,12, 13,14,15。

果蝇卵母细胞为研究减数分裂凝聚和染色体分离提供了许多优势。一个简单的基因分析允许一个人从体配子中恢复后代, 并在大规模的11、16、17中测量X-染色体隔离的保真度。此外, 你也可以确定是否出现染色体偏析错误, 因为重组同系物 missegregate 在减数分裂 I, 一个表型, 是一致的过早失去手臂的凝聚力11,18, 19. 在果蝇卵母细胞中的减数分裂状态的直接观察也可以使用荧光原位杂交 (fish)。虽然荧光寡核苷酸, 杂交重复的卫星序列已经使用了十几年来监测 pericentromeric 凝聚在成熟的果蝇卵母细胞4,20, 分析手臂凝聚力更具挑战性。手臂内聚力状态的可视化需要一个探针, 它横跨一个大区域的单拷贝序列, 并且足够明亮, 可以在缺乏手臂内聚力的情况下为单个的姐妹染色产生可见的信号。此外, 卵母细胞的固定条件和大小的标记 dna 必须促进渗透21到大成熟的果蝇卵母细胞 (200 µm 宽500µm 长)。最近, 一个手臂探针成功地用于可视化果蝇卵母细胞染色在后期 i, 但作者说, 他们无法检测信号在中期或中期我逮捕了卵母细胞22。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 以生成X-染色体臂鱼探针和卵母细胞的制备条件, 使我们能够检测早期丢失的姊妹染色单体的内聚力在中期 i 和中期 i 卵母细胞。这些技术, 使我们能够识别基因产品, 这是需要维护的减数分裂的凝聚力, 将允许其他人的姐妹染色单体内聚力缺陷的成熟的果蝇卵母细胞不同基因型。

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研究方案

1. 准备工作

  1. 准备荧光原位杂交 (fish) 的解决方案。使用超纯水准备所有解决方案。
    1. 准备5x 修改的罗布的缓冲器: 275 毫米乙酸钾, 200 毫米醋酸钠, 500 毫米蔗糖, 50 毫米葡萄糖, 6 毫米氯化镁, 5 毫米氯化钙, 500 毫米 HEPES pH = 7.4。使用 10 N 氢氧化钠将 pH 值降低到7.4。过滤消毒, 贮存在-20 ° c。根据需要解冻和稀释到 1x, 在-20 ° c 时储存1x 等分。
    2. 使用1.3 米氯化钠, 70 毫米 Na2HPO4, 30 mm NaH2PO4准备10x 磷酸缓冲盐水 (PBS)。使用 10 N 氢氧化钠将 pH 值降低到7.0。消毒灭菌或过滤灭菌。
  2. 在需要前一天准备多聚 l-赖氨酸片。
    1. 吸管70% 乙醇含有1% 的盐酸到表面的一个18毫米 x 18 毫米 #1. 5 片和孵育5分钟使用真空抽吸去除液体。重复使用无菌超纯水。用0.1 毫克/毫升的聚 l-赖氨酸片覆盖表面, 孵育10分钟。
    2. 吸出液和空气干燥10分钟片多聚 l-赖氨酸在一个塑料容器与一个紧合盖, 以避免灰尘。
  3. 准备拉巴斯德管去除液体溶液而不除去卵母细胞。在本生燃烧器的火焰, 热中间的一个长玻璃巴斯德吸管, 而轻轻地拉动每一端, 直到玻璃融化和拉分开。

2. 鱼的胳膊探针的世代

注: 所有离心机步骤在 ~ 1.6万-2.1万 x g (最大速度在多数桌顶 microcentrifuges) 执行。简要的离心机旋转表明纺纱 5-十五年代. 除非另有说明, 涡旋指示涡流的最大速度为 ~ 十五年代。

注: 巴克斯可从 BAC PAC 资源中获取臂探头。用该方法成功地使用了两个X染色体 euchromatic 臂探针。一臂探针是由六 BAC 克隆对应的细胞学带 6 e-7 b (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11)。另一臂探针包括六 BAC 克隆对应的细胞学带 2 f-3 c (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13)。巴克斯到其他果蝇染色体区域可以浏览: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html。两个第9探测器, 承认 359 bp 卫星重复的X染色体已成功使用此方法。22核苷酸探针已被广泛使用, 工作良好 (5 "-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23。最近测试了一个28核苷酸探针, 而且工作良好 (5 "-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24。HPLC 纯化的寡核苷酸 5 ' 标记的特定荧光是从商业来源 (例如, 集成的 DNA 技术) 订购的。

  1. 按照在材料表中指定的套件说明, 准备 BAC 克隆 DNA。重200µL 100 毫升培养基中获得的 DNA 颗粒;最后的 DNA 浓度应介于 5-40 ng/µL 取决于 BAC 克隆。
  2. 根据材料表和以下协议, 使用放大试剂盒对每个 BAC 进行 DNA 放大。分别处理每个克隆的 BAC DNA。在2.2.1 通过2.2.3 的步骤中使用与试剂盒一起提供的酶和缓冲器。
    1. 随机分裂的 bac dna: 每 bac, 使用 TE 准备10µL 1 ng/µL DNA 溶液在200µL PCR 管。添加1µL 10X 碎片缓冲。将试管放入 PCR 机中, 在95° c 处精确地4分钟. 立即冷却样品在冰水和离心机简要地。孵化时间敏感, 任何偏差都可能改变结果。
    2. 图书馆准备
      注意: 此方法使用随机引物生成 amplifiable 片段库。
      1. 对含有 DNA 的管添加以下内容: 2 µL 1x 库准备缓冲区, 1 µL 库稳定解决方案。将涡流、离心机进行彻底混合, 在95° c 下将试管放入 PCR 机中2分钟. 立即冷却样品在冰水和离心机简要地。
      2. 将1µL 的库制剂酶添加到 PCR 管、混合和离心机中。在 pcr 机中放置 pcr 管, 孵育如下:16 ° c 为 20 min, 24 ° c 为 20 min, 37 ° c 为 20 min, 75 ° c 为 5 min, 然后举行在4° c。
      3. 从 PCR 机中取出样品, 然后简单地离心。样品可立即放大或储存在-20 ° c 最多三天。
    3. BAC DNA 文库的扩增
      1. 将以下试剂添加到整个15µL 随机片段反应: 7.5 µL 10x 放大主混合, 47.5 µL 核酸游离水, 5 µL WGA DNA 聚合酶。涡流和离心机彻底混合。
      2. 将 pcr 管放在 pcr 机中, 孵育如下: 初始变性95° c 为3分钟, 14 循环变性在94° c 为十五年代, 其次退火/延长在65° c 为5分钟, 然后举行在4° c。
      3. 循环完成后, 测定 DNA 浓度。DNA 浓度应至少 800 ng/µL. 将样品保存在4° c 或贮存在-20 ° c, 直至消化。(可选) 通过在2% 琼脂糖凝胶上运行 400 ng dna 来评估 dna 片段的大小。片段的范围应从 200 bp 到 3 kb (图 2)。
  3. 扩增 DNA 的限制性酶消化
    1. 放置20µg 的放大 DNA 从前一节在一个1.5 毫升离心管。增加20单位的 Alul, Haelll, 毫秒, Mspl, Rsal, 25 单位 BfuCl, 0.5 µL 100x BSA, 5 µL 10x 限制酶消化缓冲, 并调整音量到50µL 通过添加适当的超纯 H2O 的数量。
    2. 在37° c 的恒温箱中孵育一夜, 以防盖子上凝结。乙醇沉淀消化的 DNA。添加到文摘: 1 µL 糖原, 1/10 卷3M 醋酸钠, 2.5 卷100% 分子级乙醇。在-80 ° c 下孵育1小时或一夜。
    3. 离心机为30分钟在4° c。用1容积的室温70% 乙醇洗涤 DNA 颗粒, 在4° c 下旋转5分钟。除去上清液, 让 DNA 颗粒空气干燥或用稳定的气流轻轻干燥。
    4. 重36µL 无菌超纯 H2O 的 dna 颗粒, 并使用1µL 的 dna 来测定 dna 浓度, 这应该是大约 285 ng/µL. 储存在-20 ° c 的 dna。
    5. 选择性地评估在2% 琼脂糖凝胶上运行 400 ng dna 的 dna 片段大小。大多数碎片的范围从 100-200 bp, 一个微弱的信号高达 500 bp (图 2)。
  4. 3 ' 尾矿反应
    1. 变性在100° c 下为1分钟的热块中的消化 DNA。立即冰水冷却。对35µL 的 DNA, 添加如下:50 µL 400 毫米钠甲, 1 µL 10 毫米的数码, 和漩涡井。添加4µL 25 mM CoCl2, 2.5 µL 2 毫米 5-(3-aminoallyl)-dUTP 从战神标记试剂盒中指定的材料表, 5 µL 1mM dTTP, 18 µL 5x TdT 缓冲, 和1µL 终端 deoxynucleotidyl 转移酶 (TdT) 400 U/µL. 涡旋和离心机简要。
      警告: CoCl2是有毒的, 请穿戴适当的保护。
    2. 孵育2小时在37° c 在一个孵化器, 以防止冷凝。加入1µL 250 毫米 EDTA, 以停止反应和涡流短暂混合。乙醇沉淀的尾 DNA 如上所述 (步骤 2.3.2-2.3.4)。重10µL 无菌超纯 H2中的干 dna 颗粒将 dna 储存在-20 ° c 直到准备继续。
  5. 使用材料表中指定的 DNA 标记试剂盒进行荧光染料共轭。
    注: 一旦添加染料, 在黑暗中保存样品。
    1. 变性在95° c 下的尾 DNA 为5分钟的热块。立即冷却脱氧核糖核酸在冰水和离心机简要地。根据试剂盒说明准备标签缓冲, 并在每个 DNA 样本中添加6µL。从试剂盒中重4µL 中的每一个染料管。漩涡和离心机简要地。
    2. 每一个标签反应使用一管染料。将染料溶液添加到 DNA、涡旋和离心机中。在室温下孵育2小时在黑暗中的标记反应。添加3µL 3M 羟胺, 以停止反应, 其次是77µL 的核酸的自由 H2O 从套件。漩涡和离心机简要地。
  6. 使用材料表中指定的 PCR 纯化试剂盒去除非共轭染料。按照制造商的说明进行操作。洗 DNA 从该列两次使用40µL 洗脱缓冲每次。
  7. 乙醇沉淀的标记 DNA 如前所述 (步骤 2.3.2-2.3.4)。重10µL 洗脱缓冲液中的干 DNA 颗粒。
  8. 准备探头混合物
    1. 对于标记的 DNA, 确定荧光染料的浓度在 pmol/µL。荧光浓度可能范围从 30-100 pmol/µL, 取决于 BAC。DNA 浓度可从 300-800 ng/µL。
      注: 微阵列设置在 microvolume 分光光度计上效果很好, 如在材料表中指定的那样。在微阵列窗口中, 选择 DNA-50, 并指定荧光。
    2. 通过结合每个 BAC 探头的摩尔量 (pmol 氟) 创建主组合。漩涡三十年代在组合之前。为了避免冻结/解冻循环, 准备等分的主混合, 应用石蜡薄膜的管, 以防止蒸发, 并在黑暗中存储在-20 ° c。
      注: 在 30-50 µL 的总体积中, 每6个 BAC 探针中的 mastermix 包含 250 pmol。一个分包含 25 pmol (氟) 为每个 bac 将是足够的两个40µL 杂交反应, 最后探针浓度 0.31 pmol 氟/µL 为每 bac。

3. 卵母细胞的解剖和固定

  1. 收集30成年处女女性的适当基因型。为了丰富晚期卵母细胞, 在解剖25之前, 在 3-5 天内, 将没有雄性的雌性在一小瓶中放入苍蝇食品和干酵母。在解剖前的前一天, 把没有气体的雌性转移到一个新鲜的小瓶子里。
  2. 进行解剖。
    注意: 有关所需工具, 请参见图 3 。除另有说明外, 使用被拉的巴斯德吸管去除解决方案。当转移卵巢总是使用吸管尖端涂敷 10% BSA 溶液。
    1. 在一个含有改良罗伯缓冲液的浅解剖盘中, 用镊子将卵巢从一个单一的雌性中取出。使用镊子或钨针轻轻扇每个卵巢, 使解决方案接触内 ovarioles。将一对张开的卵巢转移到一个1.5 毫升的离心管中, 其中含有1毫升修改过的罗伯的缓冲器。
    2. 重复步骤3.2.1 在1.5 毫升离心管中从 20-25 雌性中累积卵巢。在10分钟内完成 20-25 女性的解剖。
  3. 按如下方式进行固定。
    1. 用一个被拉扯的巴斯德吸管, 去除液体在离心管, 使用 P1000 快速地增加500µL 37 ° c 固定解答到卵巢, 然后立刻增加500µL 室温庚烷对卵巢。
    2. 摇离心管混合和放置在一个 nutator 3 分钟. 从 nutator 中取出离心管, 在管架中放置1分钟, 使卵母细胞沉淀到底部。总固定时间为4分钟。
      警告:固定解决方案和庚烷是有毒的, 穿戴适当的保护。
    3. 去除固定液, 冲洗卵巢3次在500µL 的 PBS 含有 0.5% BSA 和0.1% 海卫 X-100 (PBSBTx)
  4. 对剩余的基因型重复。

4. 去除 Chorions 和卵黄膜

注意: 有关所需工具, 请参见图 3 。

  1. 分离晚期卵母细胞
    1. 添加1毫升 PBSBTx 到一个浅解剖菜。使用 P200 与 BSA 涂层提示转移固定卵巢 (在〜150µL) 到浅盘。移液管卵巢上下与 BSA 涂层的吸管尖端, 从较不成熟的卵母细胞中取出成熟的卵母细胞。
    2. 当晚期卵母细胞充分分离时, 将所有组织转移到500µL 离心管。用拉巴斯德吸管去除多余的液体, 在试管中留下大约 150-200 µL。重复4.1 节以保留基因型。
  2. 准备滚动
    1. 预湿一个深井盘与200µL PBSBTx. 盖和预留。获得3磨砂玻璃幻灯片和设置幻灯片 #3 预留。轻轻地摩擦磨砂玻璃区域的幻灯片 #1 和 #2 在一起。在去离子水中冲洗, 去除任何玻璃碎片, 用一次性擦干。
    2. 通过将50µL PBSBTx 添加到一张幻灯片上, 并将该区域与另一张幻灯片擦除, 以 PBSBTx #1 和 #2。用一次性擦拭液除去液体。
    3. 在图 4A中显示的配置中, 将幻灯片置于解剖显微镜下。使用幻灯片 #3 支持幻灯片 #2, 保持幻灯片的磨砂区域 #1 并 #2 接触。
  3. 滚卵母细胞;确保滚动的方向始终是直线, 而不是圆周运动。
    1. 湿在 PBSBTx 中 P200 吸管尖端, 将卵母细胞在离心管中由移向上和向下分散。将含有卵母细胞的液体的50µL 转移到滑动 #1 的磨砂玻璃的中心部分。提起幻灯片 #2 这样做。
    2. 缓慢降低滑动 #2, 直到液体的表面张力在两个磨砂玻璃区域之间形成一个密封。应该有足够的液体覆盖的磨砂区, 但没有人应该渗出。如果液体溢出, 使用一个被拉扯的巴斯德吸管去除多余的液体。
    3. 用一只手按住底部滑动 (#1), 用另一只手在水平方向上来回移动顶部幻灯片 (#2), 保持幻灯片 #2 水平并支持幻灯片 #3。在显微镜下执行, 以方便地可视化卵母细胞的运动和进展。
      注: 这一运动将产生摩擦, 并导致卵母细胞 "滚", 失去他们的 chorions。应使用最小压力, 动作应短而快。
    4. 在水平方向上的几个动作之后, 稍微改变移动角度 (图 4B)。在多个增量中, 将此角度逐渐增加到90°, 直到顶部幻灯片 (#2) 的移动与起始方向垂直 (图 4B)。注意, 空的 chorions 将在液体中可见, 缺乏 chorions 的卵母细胞会显得更长更薄。
    5. 重复步骤 4.3.3-4.3.4 约 7-10 次, 直到解决方案变得有点多云。停止滚动, 当大多数卵母细胞 (75-85%) 似乎失去了他们的卵黄膜。
      注意: 在缺乏卵黄膜的卵母细胞中, 有一个明显的尖端通常可见。卵黄膜比 chorions 更难去除。轻压可应用于顶部滑动 (滑动 #2), 同时滚动, 以实现卵黄膜的去除。试图从所有的卵母细胞中去除卵黄膜通常会导致其他卵母细胞的破坏。
    6. 轻轻提起顶部滑动 (#2), 将它的一个角拖动到底部幻灯片 (#1) 的磨砂区域的中心, 以便滚动的卵母细胞聚集在磨砂区域的中心。用 PBSBTx 将卵母细胞从两张幻灯片中冲洗成含有 PBSBTx 的深井盘。
    7. 清洁幻灯片 #1 和 #2 与超纯水, 干燥与一次性擦拭, 并复位。重复步骤 4.3.1-4.3.6, 直到所有相同基因型的卵母细胞都被轧制。这通常需要 3-4 轮滚动每个基因型。
  4. 轧后清除杂物
    1. 添加1毫升 PBSBTx 到15毫升锥形管。将液体旋转以涂上管子的两侧。
    2. 使用 PBSBTx 涂层 P1000 吸管尖端, 将轧制的卵母细胞从深井盘转移到含有1毫升 PBSBTx 的锥形管中. 在含有卵母细胞的圆锥管上增加2毫升的 PBSBTx。
    3. 让卵母细胞开始沉淀到底部, 然后去掉含有碎片 (chorions、vitellines、等) 的前2毫升溶液, 并丢弃 P1000。如果需要, 按住锥管的黑暗背景, 看到不透明的卵母细胞下沉。
    4. 增加2毫升的 PBSBTx 卵母细胞, 并重复步骤4.4.3。重复4.4.3。总共3回合的碎片清除。
    5. 使用 PBSBTx 涂层 P1000 吸管尖端, 转移卵母细胞回到原来的500µL 离心管。20-25 女性应产生约50µL 的轧制成熟卵母细胞。
  5. 重复4节的剩余基因型使用新鲜磨砂幻灯片, 一个干净的深井盘, 和一个新的锥形管每一个基因型。
  6. 如果储存是必要的, 转移卵母细胞到 1x PBS 与 0.1% TritionX-100 和商店隔夜在4° c。长期储存是不建议的, 因为甲醛交联可以逆转的非离子洗涤剂。

5. 鱼

注: 除另有注明外, 所有洗涤均在室温下的 nutator 上进行。已被轧制的卵母细胞需要更长的时间才能沉淀到离心管的底部, 特别是在含有甲酰胺的溶液中。重要的是要有耐心, 当改变解决方案, 使卵母细胞在过程中没有丢失。这可能需要等待 5-15 分钟, 让卵母细胞在漂洗和洗涤后解决。还要注意的是, 甲酰胺中的卵母细胞不透明。

  1. 提取和核糖核酸处理
    1. 用500µL 的 PBS 冲洗卵母细胞, 含有 1% X-100 (PBSTx)。取出液体并添加500µL 萃取缓冲器 (PBSTx 含有核糖核酸)。室温下在 nutator 上孵育2小时。
  2. 预杂交洗涤
    1. 用500µL 2x 生理盐水, 含吐温 20 (SSCT) 冲洗卵母细胞3次。预热一分 (〜500µL/基因型) 的 2x SSCT + 50% 甲酰胺到37° c。
      警告:甲酰胺是有毒的, 穿戴适当的保护。
    2. 清洗卵母细胞3次, 每10分钟500µL 2x SSCT。洗涤卵母细胞10分钟在500µL 2x SSCT + 20% 甲酰胺。洗涤卵母细胞10分钟在500µL 2x SSCT + 40% 甲酰胺。洗涤卵母细胞10分钟在500µL 2x SSCT + 50% 甲酰胺。
    3. 去除液体, 并添加500µL 37 ° c 2x SSCT + 50% 甲酰胺从步骤5.2.1 样品和孵化2小时在37° c 与旋转。
      注: 配有旋转装置的杂交烤箱工作良好。一个泡沫离心管 "浮动" 连接到转子可以用来确保管。
  3. 变性和杂交
    1. 对于每一个卵母管, 使用40µL 1x 杂交缓冲包含 2.5 ng/µL 丝探针和 0.31 pmol 氟/µL 的每个 BAC 探头。为所有基因型的杂交缓冲液准备一个探针的解决方案。涡流探头混合三十年代前加入。
    2. 使用 BSA 涂层 P200 吸管尖端, 转移卵母细胞到200µL PCR 管。保持样品在37° c, 让卵母细胞沉淀到底部, 然后使用一个被拉的巴斯德吸管移除尽可能多的液体。
    3. 加入40µL 的杂交溶液含有探针 (在2节中制备) 卵母细胞。在 pcr 机中放置含有卵母细胞的 pcr 管, 孵育如下:37 ° c 为5分钟, 92 ° c 为3分钟, 然后37° c 过夜。在将探针添加到卵母细胞后, 尽量让它们在黑暗中。
  4. 杂交后洗
    1. 预热 2x SSCT + 50% 甲酰胺至37° c, 并将其保存在杂交孵化器中。与 BSA 涂层 P200 吸管尖端, 添加100µL 37 ° c 2x SSCT + 50% 甲酰胺 PCR 管与卵母细胞和转移卵母细胞到一个新的500µL 离心管。
    2. 增加一个额外的400µL 37 ° c 2x SSCT + 50% 甲酰胺对同一管, 让卵母细胞落户在37° c 的孵化器。
      注: 在这一步, 沉淀往往需要更长的时间。这是不寻常的采取15分钟或更长的时间。缺乏耐心将导致大量的卵母细胞丢失。
    3. 在500µL 37 ° c 2x SSCT + 50% 甲酰胺在37° c 与自转洗涤卵母细胞3次为 20 min 每个。在37° c 时将卵母细胞保存下来。
    4. 在500µL 37 ° c 2x SSCT + 50% 甲酰胺在37° c 与自转洗涤卵母细胞3次为 10 min 每个。在37° c 时将卵母细胞保存下来。
    5. 在室温下, 清洗卵母细胞10分钟, 在500µL 2x SSCT + 40% 甲酰胺 nutator。在500µL 2x SSCT + 20% 甲酰胺中洗涤10分钟的卵母细胞。在500µL 2x SSCT 中清洗卵母细胞10分钟。
  5. 染色带 DAPI
    警告: DAPI 是有毒的, 穿戴适当的保护。
    1. 在 nutator 的 2x SSCT 中, 在500µL DAPI 溶液 (1 µg/毫升) 中洗涤卵母细胞20分钟。在500µL 2x SSCT 中冲洗卵母细胞3次。清洗卵母细胞2次, 每10分钟在500µL 2x SSCT 在 nutator。样品可以在室温下储存多达4小时, 直到他们准备好在片上安装。
  6. 安装
    注意: 有关所需工具, 请参见图 3 。
    1. 在解剖显微镜下放置一聚 l-赖氨酸涂层片。从卵母管中取出液体, 将总体积调整到大约150µL。与 BSA 涂层 P200 吸管尖端, 吸管向上和向下分散卵母细胞在整个解决方案, 然后转移40µL 的卵母细胞/解决方案的多聚 l-赖氨酸涂层片。
    2. 从片中取出一些液体, 使用拉巴斯德吸管, 直到卵母细胞粘在片上, 但仍被液体包围。用镊子, 按住一侧的盖子滑动, 并使用钨针轻轻地离解卵母细胞块, 移动他们实现一层非重叠的卵母细胞。
    3. 用被拉的巴斯德吸管移除卵母细胞周围液体的其余部分。拿一张干净的玻璃滑梯, 用压缩气体吹掉任何灰尘。在幻灯片中间添加22µL 的安装介质 (例如, 延长-金色)。慢慢地降低幻灯片对片, 与安装媒体面对样品, 直到媒体接触的样品。表面张力会使片粘附在幻灯片上。
    4. 将幻灯片放在带有紧合盖的塑料容器中, 其中包含一层新的干燥剂 (例如, drierite)。让幻灯片干燥 3-5 天在黑暗中前成像。干燥时间可能会因房间的湿度而异。

6. 成像

  1. 在从干燥剂的盒子中取出干燥的幻灯片后, 将其清除以清除灰尘颗粒。用指甲油密封片。密封的幻灯片可以无限期地存储在-20 ° c。
  2. 使用高数值孔径40X 油目标和6X 数字变焦获取激光扫描共聚焦图像。
    注意: 理想情况下, 系统软件将允许一个发现和标记的 X Y 位置的减数分裂染色体的多卵母细胞, 同时查看他们使用荧光。此功能可在映像会话期间节省时间。快速漂白与高数值孔径60X 目标使它的用途不适合与选择的共焦系统, 但它可能为其他系统工作。
  3. 捕获每个卵母细胞的 Z 系列, 使用 DAPI 信号设置该系列的顶部和底部。
    注: 增益, 偏移, 和激光功率将需要用一个子集的卵母细胞经验来确定。一旦找到合适的参数, 只需要进行轻微的调整。
    如果需要更改的购置设置, 请使用以前收集的图像堆栈来估计必要的变化。为了避免漂白, 在捕捉 Z 系列之前, 不要在手臂探头前成像。以0.25 µm 的步长, Z 系列通常范围从25到30步取决于染色体的方向和位置。一个较小的步长可能会提高一个人的能力, 以评估是否两个鱼点分开在轴向尺寸, 但有一个贸易关闭的时间, 以捕获较小的步骤和失去信号强度由于漂白。一个40X 的目标与6X 数字变焦和 1024 x 512 图像字段生成图像的像素大小为0.05 µm。

7. 图像分析和粘结缺陷评分

  1. Deconvolve Z 系列以优化每个卵母细胞19的信噪比。
    注意: 一个软件包 (如材料表中指定的软件包) 允许一个 deconvolve 使用集成还原, 以及裁剪和增强对比度图像。重要的是, 一个软件包, 允许一个查看图像和评分的凝聚力缺陷在三维度是当务之急。
  2. 对于每个卵母细胞, 制表的数量的手臂和丝病灶, colocalize 与 DAPI 信号。失去凝聚力的结果在三或四不同的和分离的信号为一个特定的探头。观察由细线连接的两个病灶并不少见。根据最严格的标准, 这些焦点不会被认为是 "分离的"。

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结果

图 5显示了在X染色体上 hybridizes 到细胞学区域 6 e-7 b 的臂探针中获得的图像。该探针的结果是与 DAPI 的本地化的信号, 很容易区分与背景, 并已成功地用于量化的手臂凝聚力缺陷的不同基因型的19。粘聚缺陷的量化仅限于中期 i. 期和中期 i 阶段;核包膜破裂之前的卵母细胞被排除在分析19之外。一个完整的核信...

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讨论

使用鱼探针评估中期 i 和中期 i果蝇卵母细胞的臂部凝聚状态是在果蝇减数分裂领域的一个重要进展。从历史上看,果蝇研究人员已经被限制在成熟的卵母细胞中推断出过早丧失手臂的凝聚力11,18,19。现在, 用这里所提出的方法, 可以直接使用鱼来测定手臂的内聚力状态。获得身体证据的能力过早失去了手臂的...

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披露声明

作者声明没有竞争的金融利益。

致谢

这项工作得到了 NIH 授予 GM59354 颁发给沙龙 e. Bickel 的支持。我们感谢 Huy, 阮协助开发的协议, 产生荧光手臂探头, Ann Lavanway 的帮助与共焦显微镜, j. 因苏阿芦苇技术援助。我们还感谢果蝇社区的许多同事提供有益的讨论和建议。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Midi Prep kitQiagen12143Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kitInvitrogenA21676Label BAC clone DNA
PCR purification kitQiagen28104Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chlorideFisher ScientificC75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfateSigmaD-8906
DrieriteDrierite Company23001
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen15508-013Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl)Boehringer Mannheim1277049Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)Fisher ScientificS311-500Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof)Decon Laboratories2716
Tris (Ultra Pure)Invitrogen15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)SigmaE-3889
16% formaldehydeTed Pella, Inc.18505Toxic: wear appropriate protection
FormamideInvitrogenAM9342Toxic: wear appropriate protection
GlucoseFisher ScientificD16-1
GlycogenRoche901393
HEPESBoehringer Mannheim737-151
HeptaneFisher ScientificH350-4Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acidMilliporeHX0603-4Toxic: wear appropriate protection.
HydroxylamineSigma438227Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chlorideSigma104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml)SigmaP8920-100
Potassium acetateFisher ScientificBP364-500
Sodium acetateFisher ScientificS209-500Prepare 3M stock
Sodium cacodylatePolysciences, Inc.1131Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrateFisher ScientificBP327-1
Sodium chlorideFisher ScientificS271-3Sodium chloride
SucroseFisher ScientificS5-500
10% Tween 20Thermo Scientific28320Surfact-Amps
10% Triton X-100Thermo Scientific28314Surfact-Amps
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate)3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solutionToxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solutionToxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase)1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
NameCompanyCatalog NumberComments
Enzymes
AluINew England BiolabsR0137S
HaeIIINew England BiolabsR0108S
MseINew England BiolabsR0525S
MspINew England BiolabsR0106S
RsaINew England BiolabsR0167S
BfuCINew England BiolabsR0636S
100X BSANew England BiolabsComes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2New England BiolabsRestriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µlRoche/Sigma3333566001
TdT bufferRoche/SigmaComes with TdT enzyme
Cobalt chlorideRoche/SigmaToxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL)Thermo-ScientificEN0531
NameCompanyCatalog NumberComments
Cytology Tools etc.
ForcepsDumont#5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettesFisher13-678-20CAutoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dishCustom made
Deep well dish (3 wells)Pyrex7223-34
Fisherfinest Premium microscope slidesFisher Scientific22-038-104Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mmVWR Scientific48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thickThermo-Scientific3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5Thermo-Scientific3405
Tungsten needlehomemade
Prolong GOLD mounting mediaMolecular ProbesP36930
Compressed-air in canVarious
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR machineVarious
Nanodrop 2000, spectrophotometerThermo-Scientificmicrovolume spectrophotometer
VortexerVarious
Table top microfuge at room temperatureVarious
Table top microfuge at 4 °CVarious
Heat blockVarious
Hybridization oven or incubator with rotatorVarious
NutatorVarious
A1RSi laser scanning confoalNikon40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables etc.
50 mL conical tubesVarious
15 mL conical tubesVarious
1.5 mL microfuge tubesVarious
500 µl microfuge tubesVarious
200 µl PCR tubesVarious
Plastic container with tight fitting lidVariousTo hold Drierite
KimwipesVariousdisposable wipes
ParafilmVariousparaffin film
NameCompanyCatalog NumberComments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesCy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis SoftwarePerkinElmerVersion 6.3

参考文献

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