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摘要

这篇手稿描述了一个详细的标准化协议高通量 16S rRNA 扩增子测序。该协议引入了一个集成的, 统一的, 可行的, 廉价的协议, 从粪便样本收集, 通过数据分析。该协议允许分析大量的样本, 严格的标准和几个控制。

摘要

人体肠道菌群在保护细胞免遭伤害、处理能量和养分以及促进免疫力方面起着重要作用。从被认为是健康的微生物组成 (dysbiosis) 的偏差可能会损害导致病理状况的重要功能。最近和正在进行的研究工作已被用于描述微生物组成与人类健康和疾病之间的关联。

高通量测序技术的进展使肠道微生物成分的特征得以表征。这些方法包括 16S rRNA 扩增子测序和猎枪测序。16S rRNA 扩增子测序用于分析分类成分, 而猎枪测序则提供有关基因预测和功能注释的附加信息。使用 16S rRNA 基因可变区的目标测序方法的优点是它的成本与猎枪测序相比大大降低。在 16S rRNA 基因中的序列差异被用作微生物指纹, 用来识别和量化个体样本中不同的分类群。

主要的国际努力已登记了 16S rRNA 扩增子测序标准。然而, 一些研究报告了一个常见的变异来源, 由间歇效应引起。为了最小化这种效果, 必须实现示例收集、处理和排序的统一协议。该协议提出了从粪便样本采集开始到数据分析的广泛应用协议的集成。该协议包括无列的直接 pcr 方法, 能够同时处理和 DNA 提取大量粪便样本, 以及 V4 区域的 PCR 扩增。此外, 该协议描述分析管道, 并提供一个脚本使用最新版本的 QIIME (QIIME 2 版 2017.7. 0 和 DADA2)。这一步步协议的目的是引导那些感兴趣的人开始使用 16S rRNA 扩增子测序的健壮, 繁殖, 易于使用, 详细的方式。

引言

为了更好地了解微生物的多样性和丰度, 已作出了集中努力, 作为在健康和病理条件下捕捉个体差异和相似性的另一个方面。年龄2,3, 地理4, 生活方式5,6, 疾病5被证明与肠道微生物组的组成有关, 但许多条件和人口尚未完全特点.最近据报道, 微生物菌群可以被修改为治疗性应用7,8,9。因此, 进一步了解各种生理条件和微生物组成之间的关系, 是迈向优化未来潜在的修改的第一步。

传统的微生物培养方法受低产量的限制10,11, 并被概念化为一个二进制状态, 其中细菌是存在于肠道或没有。高通量 DNA 测序已经彻底改变了微生物生态学, 使微生物群落的所有成员都能被捕获。但是, 序列读取长度和质量仍然是精确分类分配12的重要障碍。此外, 基于高通量的实验可能会受到批处理效果的影响, 其中测量受非生物或非科学变量13的影响。近年来, 已经建立了一些研究人类微生物菌群的方案, 包括美国肠道项目、美国 (美国) 人类微生物学项目和联合王国 (英国) MetaHIT 项目。这些倡议产生了大量的数据, 由于它们的做法缺乏连贯性, 因此难以比较。各种国际项目, 如国际人类微生物菌群联合会、国际人类微生物菌群标准项目以及国家标准和技术研究所 (NIST) 试图解决其中的一些问题14, 并制定了微生物菌群测量标准, 这将有助于实现可靠的生殖结果。这里描述的是一些广泛使用的方法15、16的集成协议, 用于 16S rRNA 高通量测序 (十六年代序列), 从粪便样本收集通过数据分析开始。该议定书描述了一种无柱 PCR 方法, 最初设计用于直接提取植物 DNA16, 以便在相对较短的时间内同时处理大量的粪便样本, 并以高质量的扩增 DNA 为靶向常规测序平台上微生物变量 V4 区域的测序。该议定书的目的是引导感兴趣的科学家开始使用 16S rRNA 扩增子测序, 在健壮, 生殖, 易于使用, 详细的方式, 使用重要的控制。具有引导和详细的分步协议可能会减少批处理效果, 从而允许在实验室之间进行更可比较的排序结果。

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研究方案

该研究的伦理批准是由示巴地方研究伦理学委员会批准的, 所有方法都是按照相关的指导方针和条例进行的。该议定书收到了当地道德审查委员会的病人同意例外, 因为使用的粪便材料已经作为临床检查的一部分提交给微生物学核心, 而没有其他人的年龄以外的可识别的病人信息,性别和微生物结果。从健康志愿者那里获得书面、知情的同意, 机构审查委员会批准了这项研究。其中一些示例已包含在以前的分析1中。

1. 样品处理

  1. 收集一个大约5毫米2涂片 (大致大小的铅笔橡皮擦) 从一个新鲜的粪便样本与无菌拭子在试管 (见材料表)。将含有粪便样品的所有拭子贮存在24小时内-80 摄氏度。粪便拭子可以留在那里, 直到进一步处理。

2. DNA 提取

  1. 在室温下解冻萃取和稀释液 (请参阅材料表)。
  2. 将粪便拭子转移到空的2毫升收集管 (请参阅材料表)。通过使用干净的剪刀来调整拭子棒的尺寸, 以使管道闭合时具有最小的交叉污染。加入 250 ul 的萃取液, 每个收集管含有粪便拭子和漩涡混合。
  3. 在沸腾的水浴中加热样品10分钟 (95–100°c).添加 250 ul 稀释溶液的每个样品和涡流混合。
  4. 储存2毫升的管含有提取的 DNA 和拭子在4摄氏度。

3. PCR 和图书馆准备

对于步骤3.1 和 3.2, 在提供干净、模板和扩增子自由环境的 PCR 工作站中工作。

  1. 根据其条码标记底漆 (表 1)。将双蒸馏水 (DDW) 中的每一底漆稀释至50微米浓度, 并贮存在-20 摄氏度。
  2. 用96井板进行 PCR 反应。每个盘子可以包含32不同的样品, 由32个不同的索引引物标记。在室温下解冻前底漆和32反向底漆, 稀释至5微米。
  3. 准备 pcr 反应混合100反应 (每个井的最终体积将是 20 ul) 混合 100 ul 的5微米前底漆, 1 毫升 2X PCR 主混合, 和 400 ul DDW。把这个 PCR 混合在每个井 (总共96口井) 15 ul。将每5微米反向索引底漆的 1 ul 添加到3个不同的井 (triplicates 中32种不同的引物, 总共提供96个井)。
  4. 在预 PCR 专用区, 这意味着一个干净的长凳, 是模板和扩增子免费, 添加 4 ul 的每一个提取的 dna 样本到反应混合物 (每个提取的 dna 样本被放大32个样本每 96-井板)。
  5. 运行 PCR 与以下设置: 初始变性94°c 3 分钟;其次35周期变性在94°c 为1分钟, 退火在55°c 为1分钟和延长在72°c 为1分钟;和最后的延伸在72°c 为10分钟。
  6. 在一个不同的长凳上, 这将被定义为后 pcr 专用区, 结合每三个 pcr 反应成一个单一的容积管 (60 ul 每样品)。
  7. 为了评估 pcr amplicons 的质量, 在溴溴染色的1% 琼脂糖凝胶上, 对每个联合 pcr 反应运行 4 ul。在紫外波长为 260 nm 的情况下, 正 amplicons 将出现在预期的 375–425 bp 波段大小。只有这些 amplicons 将包含在后续步骤中。
    注: 每样样品都有三份放大, 这意味着每个样品在3种不同的 PCR 反应中被放大。不要放大。

4. 图书馆量化和清洁

  1. 为了获得所有 PCR 样品的摩尔浓度池, 用双链 DNA (dsDNA 定量试剂) 荧光灯核酸染色 (参见材料表) 量化每个扩增子, 适合于同时量化大型样本量。
    注: 由于扩增子的尺寸范围是模棱两可的, 毫微克的实际用量用于加载摩尔浓度。
  2. 将每个样品的 500 ng 组合成一个单一的无菌管。漩涡混合。
  3. 在一个溴溴染色的1% 琼脂糖凝胶上运行 200 ul 的汇集图书馆。根据制造商的说明 (请参阅材料表) 并洗脱 80 ul DDW 中的汇集库, 从凝胶中提取 375–425 bp 带。
    注: 池库应选择大小, 以减少来自宿主 DNA 的非特定放大产品。
  4. 根据制造商的说明, 使用高度敏感的 dsDNA 检测套件测量最终库浓度 (请参阅材料表)。根据制造商的说明, 使用对 DNA 库的高度敏感的分离和分析工具包测量准确的库大小 (请参阅材料表)。

5. 测序

  1. 根据顺序机协议, 将池库稀释到下午7点, 并添加20% 控制库 (参见材料表)。
  2. 对于排序, 使用自定义的 V4 放大引物免费的读引物 (请参见表 1)。
  3. 根据制造商的规范, 使用第三个自定义的测序底漆, 在附加周期中读取条形码 (请参见表 1), 并在每个方向上生成175个基的配对端读取。
  4. 根据制造商的协议, 运行顺序机并获取 FASTQ 文件。

6. 数据处理

  1. 在 QIIME 2 版 2017.7. 017中实现的数据精选管线中, 缝合并处理重叠的配对端 FASTQ 文件。根据示例特定的条形码解读取。
  2. 使用 DADA218进行质量控制和序列变体 (SVs) 检测。将读取从 3 ' 端和15个基点从 5 ' 端截断13个基元, 丢弃超过2个预期错误的读取。使用协商一致方法识别和删除合体-合体分别在样本中检测到, 并且在样本的足够部分中发现嵌合体的序列被删除。
  3. 使用朴素的贝叶斯拟合分类器执行 SVs 分类分类, 在 2013年8月99% 标识 Greengenes 数据库6上进行培训, 用于175长时间读取和正/反向底漆集。
  4. Rarefy 所有样本的深度为2146个序列。
  5. 在稀薄的样品上使用加权 UniFrac 测量β多样性 (样品多样性19,20), 以避免样本大小的影响。
  6. 使用所得到的距离矩阵来执行主坐标分析 (PCoA)。
    注意: 数据处理脚本和映射文件作为补充材料提供 (辅助材料 1和2)。

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结果

该协议的示意图说明显示在图 1中。

我们有前瞻性收集的粪便样本, 从住院病人疑似传染性腹泻。这些样本是在2月至2015年5月期间提交给示巴医疗中心的临床微生物学实验室的, 如前所述的1。粪便标本在临床微生物学实验室进行常规微生物培养, 并在十六年代平行的范围内进行广泛的高?...

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讨论

16S rRNA-扩增子和 metagenomics 猎枪测序在临床微生物学应用中得到了普及21, 2223.这些技术有利于提高捕获可培养和非可培养类群的能力, 提供有关致病接种的相对丰度的数据, 以及它们识别更精确的 polymicrobial 传染性的能力。指纹24。微生物研究领域的进展产生了大量的数据, 由于各种方法缺乏一致性, 因此难以比较。最近几年, 一些财团试...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作的一部分是由核心项目 (赠款 41/11)、以色列科学基金会 (908/15 号赠款) 和欧洲克罗恩病组织 (ECCO) 支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2

参考文献

  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
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  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
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  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
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  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
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  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
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  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617(2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226(2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

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