基于球形的头颈部鳞状细胞癌3D 细胞培养模型的治疗试验

摘要

我们描述了一个基于球体的三维体外模型的进化, 它使我们能够测试细胞系头颈部鳞状细胞癌实验治疗方案的现行标准, 旨在评估治疗未来人体标本对原代细胞的敏感性和耐药性。

摘要

目前的治疗方案的晚期和复发头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 包围辐射和化疗的方法与或没有手术。虽然铂基化疗方案目前代表的是金标准的功效, 并在绝大多数情况下, 新的化疗方案, 即免疫疗法正在出现。然而, 无论是化疗方案的反应率和治疗耐药性机制都难以预测, 而且仍未得到充分了解。目前已知的化疗和耐辐射机制的广泛变化。本研究介绍了一种标准化的高通量体外检测方法, 以评估 HNSCC 细胞系对各种治疗方案的反应, 希望能将个体患者的原细胞作为个性化肿瘤的未来工具。治疗。本试验的目的是将 HNSCC 患者的质量控制标准算法纳入我们的三级护理中心;然而, 这将是未来研究的主题。从实际患者的肿瘤活检中, 技术可行性看起来很有希望。标本然后转移到实验室。活检是机械分离后, 酶消化。细胞, 然后培养在超低黏附细胞培养瓶, 促进可再生, 标准化和自发形成三维球形细胞企业集团。球体然后准备在必要时暴露在化学辐射协议和免疫治疗协议中。最终细胞生存能力和球体大小是治疗敏感性的指标, 因此可以考虑在未来评估患者的可能的治疗反应。这一模式可能是一个宝贵的, 经济高效的工具, 以个性化治疗头颈癌。

引言

头颈鳞状细胞癌 (HNSCC) 是世界上第六最常见的癌症, 其发病率上升, 粘膜人乳突病毒 (HPV) 感染相关的发病机制, 在大多数情况下, 过量的尼古丁和酒精引起消耗量^1,2。虽然较小的肿瘤和前侵入阶段通常是很好的治疗与手术切除, 通常结合宫颈淋巴结清扫, 晚期和复发 HNSCC 治疗仍然是挑战, 由于侵袭性肿瘤侵袭转移扩散和抗辐射和化疗协议^3,4,5,6,7,8。最近的研究表明细胞表型的变异很高, 循环和弥散肿瘤细胞的亚型特征刚刚开始^9,10。早期对固体、均匀肿瘤质量的信念必须根据最近几年的研究进行修订^:11,^12,13,14。目前的肿瘤鉴定和关键突变鉴定方法可以识别出一些与治疗耐药性相关的基因, 但仍然是一种成本密集型的方法。而且, 基因型的知识并不一定能对表型及其治疗反应作出可靠的预测。

在改善晚期和复发性疾病的总体和无疾病生存方面, 进展甚少。对于尼古丁-以及与病毒相关的癌症, 目前的治疗方案除了手术外, 还附上了积极的辐射和铂基化学疗法。对 HPV 阴性和阳性癌的反应速率有不同的影响;然而, 这还没有导致一般治疗指南的改变。抗辐射和化疗是在所有肿瘤阶段普遍存在的现象, 并存在于铂基化疗以及靶向治疗 (抗 EGFR;表皮生长因子受体)和最近出现的检查点抑制¹⁵。无效的放疗和化疗在吞咽困难、粘膜炎、干口和肾脏或心脏功能下降的风险等方面有很高的病人发病率。预测治疗反应之前, 对每个病人的一般治疗概念的决定似乎是关键的目标, 防止不必要的治疗概念, 副作用和成本。

我们试图建立一个模型, 以测试病人的治疗敏感性目前标准的化疗-辐射, 可纳入常规和质量控制的肿瘤治疗算法从一个技术的站点。远的目标是使用该模型, 而不使用严重改变和老化细胞系, 因为他们不太代表实际的人肿瘤细胞没有他们的变异性和异质性, 因为我们现在知道, 而建立的协议是在不同的细胞系进行。为了独立于商业上可用的细胞线, 我们最近成功地从人类肿瘤标本的原始 HNSCC 细胞中生成了一种称为 "异食癖" 的中间细胞线, 其表面和有限通道上有保守的细胞标记¹⁶. 这个异食细胞系应作为一个准备, 以发展的道路上, 然后以后的试验与新鲜的人类癌细胞从肿瘤活检。已经表明, 三维细胞培养细胞在体内的反应不同, 并且比在单分子膜^17,18,19,20 中生长的肿瘤药物的治疗更像是癌症药品的管理.²¹, 主要是由于某些单元格子集^{22 、23、24}的迁移和分异属性的保护。在这里, 我们描述了从中间细胞线和原发性人鳞状细胞癌细胞的球体为基础的三维模型的协议, 以及如何将这种模型整合到头颈外科医生和肿瘤学家的癌症治疗中 (图 1)。

研究方案

本手稿中所显示的所有研究, 即人类肿瘤标本的使用, 均受《美因茨大学医学》/慕尼黑大学医学中心伦理委员会的事先决定的保护。根据国家法律准则, 病人同意科学使用在其治疗过程中获得的过量生物材料, 因此, 患者已给予知情许可。已按照所有机构、国家和国际人类福利准则进行研究。

1. 头部和见鬼鳞状细胞癌的肿瘤活检

1. 执行一般 (异丙酚和/或七氟醚, 肌肉放松剂) 或局部浸润 (2% ultracaine, 肾上腺素)/表面 (利多卡因) 麻醉在手术室或耳鼻喉检查椅。在口腔/咽/喉/上消化道和呼吸道的其他部分用标准操作仪器可视化肿瘤肿块, 如有需要, 在显微镜下观察。
2. 用钝器或切割器械在癌性病变的周围进行新的肿瘤活检。避免因本区大量坏死导致病灶中心。将所获得的组织放在一个无菌容器中, 采用等渗氯化钠溶液。
3. 活检后, 进行必要的止血, e. g, 与双极或单凝血装置, 除了使用缩血管物质。
4. 将用于细胞培养实验的肿瘤活检直接应用于相邻的实验道。像往常一样向病理学家发送其他肿瘤活检以排除癌症。
5. 确保实验室技术员可以直接处理样品。

2. 处理肿瘤标本

1. 把肿瘤标本放在一个合适的和不育的表面上, 用一把无菌的单用手术刀彻底切开, 尽可能少的片断。
   注意: 确保感染性和血液传播的疾病的状况有充分的记录, 技术员注意到机构的标准协议, 以防止针棒或切割伤害与潜在的生物危害患者材料和可能受伤后的后续议定书。
2. 在有足够的机械分离的主要组织后, 将组织放入含有胶原酶 I/II 的瓶子中, 并在37摄氏度孵育1小时。筛过70µm 猎鹰细胞过滤器, 并用汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 冲洗悬浮液。
3. 成功分离和随后清洗后, 将包含 1-2 x 10⁶单元格的悬浮液放置到 T75 细胞培养烧瓶 (75 厘米²) 中, 以在 5% CO₂和温度为37摄氏度的情况下增加到子融合。此步骤可能需要10天。
   1. 使用特殊角质细胞培养培养基, 包括: 125 毫升 Dulbecco 的修饰鹰培养基 (DMEM), 250 毫升角质细胞补充培养基 (补充培养基, 包括500毫升角质细胞 SF 培养基, 15 毫克牛垂体提取物 (BPE), 2.5 毫升青霉素/链霉素, 150 ng 重组人上皮生长因子 (EGF), 516 µL 300 毫米 CaCl₂, 预先准备的库存混合), 125 毫升 F12 营养混合物, 10 毫克 BPE (0.75 毫升), 75 ng 重组人 EGF (2 µL), 3.75 毫升200毫米 l-丙-Glutamin 二肽 (材料表)。

3. 将细胞播种到超低黏附细胞培养板中

1. 在显微镜下确认肿瘤细胞的生长。将培养基中的细胞 (主要或细胞培养) 和种子5000主要肿瘤细胞或 1,000-2, 000 细胞的中间细胞线/其他细胞系在200-300 µL 的介质中 (步骤 3.2) 成一个超低粘附板, 凹, 圆底 (96-井)。
2. 培养细胞在 5% CO₂在37°c 和在相等的部分 DMEM 和气道上皮细胞培养基 (BEGM), 10% 胎牛血清, 1% 青霉素/链霉素, 1% 钠丙酮酸, 1% 非必需氨基酸, 1% l-谷氨酰胺 (步 2.3.)。如果使用细胞线, DMEM 的基础上的介质就足够了。
   1. 每隔一天执行一次媒体更改。注意不要在介质变化过程中用吸管吸入球体。文化球体直到增长水平作为 descibed 在3.3 被到达 (大约7-10 天)。
3. 通过寻找三维球形细胞企业集团, 在显微镜下确认自发球体的形成。排除不规则和/或多球体形成的井进一步调查。
   注: 球体应该是肉眼可见, 也有助于进一步处理和媒体的变化, 如下所述。

4. 将球体暴露于多模标准或实验性肿瘤治疗中

1. 选择一个理想的治疗方案。设计足够大的控制组, 允许比较治疗球体或球体只接受部分治疗方案, e. g。仅辐射。控制组的大小取决于实验组的设计, 不能普遍定义。
2. 用添加剂将介质与介质交换, 即在所需浓度下化疗和/或单克隆抗体的培养基。添加顺铂浓度为 2.5/5/10 µM 或 5-fluoruracil (5FU) 在30µM。
   注: 对于高通量实验或大组大小/大量组, 我们可以使用自动吹打机器人, 因为我们正在进一步建立在实验中。
3. 或者, 用合适的辐射设施在2球体的细胞培养板上辐射。
   注意: 尊重该机构关于防止雇员有害辐射暴露的议定书。根据辐射防护指导方针, 只与指定和训练有素的技术人员合作。如有需要, 添加化疗, 如下所述4.2。之后。
4. 在先前描述的培养条件 (37 °c, 步骤 3.2) 孵育细胞24小时。
5. 孵化后, 每隔一天, 继续进行细胞培养至少6天的介质变化。

5. 评估读取的球体大小和细胞增殖的程度

1. 用图形软件 (参数 1) 在6天 (10 天, 16 天) 的数字照片文档中测量球体大小。
2. 离心后在 520 x g 2.5 分钟的板, 取出上清。用足够数量的 1x PBS 冲洗细胞, 再将盘子重新离心, 然后将其移除上清 (PBS)。
3. 添加100µL 酶细胞脱离溶液, 以使球体溶解。在37摄氏度孵育8分钟的盘子。
4. 检查显微镜下球体是否成功溶解。添加100µL 的 DMEM。离心板在 520 x g 2.5 分钟. 取出上清液并将细胞悬浮在100µL 的 DMEM 中。
5. 根据制造商的说明²⁵, 执行一项商业上可获得的比色扩散试验, 例如, 在每个瓶子上 WST-8 化验。阅读酶联免疫吸附试验 (ELISA) 阅读器 (参数 2) 中的检测。

结果

我们能够重现性产生球体从单细胞悬浮, 首先从不同的细胞系, 包括专有的异种细胞系, 后来从最初的人类癌细胞的新肿瘤活检中所描述的哈格曼et al.²⁶. 我们评估了两种已建立的球体生成方法;两者是所谓的吊滴 (HD) 方法和超低粘附 (ULA) 方法, 后者是更有效和安全的一个。我们能够突出的优势, ULA 方法相比, HD, 包括更快的球体增长, 更少的问题, 板处?...

讨论

我们能够建立一个协议, 以产生可再生的球体从细胞悬浮, 对细胞系和在初步实验中, 原发性人类肿瘤细胞。我们首先评估了两种以前描述的方法, 并确定了 ULA 方法, 这种方法是使用超低粘附表面的培养板, 是一个更安全, 更可靠的三维球体生成。通过结合两种不同的方法来测定读出 (大小/面积和细胞的生存能力), 这种多模式检测是足够敏感, 以确定小的差异组之间。这是迈向技术可行性证明的第一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350