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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以显示如何实现细胞 photoconversion 是通过紫外线照射到特定区域表达荧光蛋白, Eos, 在活体动物。

摘要

动物和植物组织由细胞的不同的人口组成。这些细胞随着时间的推移相互作用, 以建立和维持组织, 并可能导致疾病时中断。科学家们通过在细胞子集中表达荧光蛋白, 开发出巧妙的技术来研究这些细胞在完整组织中的特性和自然动力学。然而, 有时, 实验需要更多的细胞在组织内的可视化, 有时候是在单细胞或细胞群的方式。为了实现这一目标, 并在细胞中显示单个细胞, 科学家们利用了荧光蛋白的单细胞 photoconversion。为了演示这项技术, 我们在这里展示了如何将紫外线照射到一个在完整的、活的斑马鱼身上表达出感兴趣的 Eos 细胞。然后, 我们在24小时后对那些 photoconverted Eos+单元格进行映像, 以确定它们在组织中的变化。我们描述了两种技术: 单细胞 photoconversion 和 photoconversions 的细胞群。这些技术可用于可视化细胞相互作用, 细胞命运和分化, 细胞迁移, 使其成为一种技术, 适用于许多生物学问题。

引言

多个不同的细胞相互作用, 建立和维持复杂的动物和植物组织。这些细胞往往是夹层和难以区分与邻居在一个单一的细胞水平没有高分辨率显微镜, 需要固定的组织。然而, 要了解这些组织是如何形成的, 如何保持, 并成为病态, 就必须研究组织内的单个细胞在一段时间内是如何相互作用的。理想情况下, 这些实验要求在不需要固定的情况下, 用非侵入性的方式对组织内的单个细胞进行标记。科学家们现在已经开发了许多技术来完成这个任务1,2,3,4。

水母绿色荧光蛋白 (GFP) 的发现和实施是一种令人兴奋的方法, 允许在组织环境1中标记不同的细胞。使用特定于单元格的启动器, 可以从遗传学上选择标记为1的单元格子集。或者, 病毒诱导的 gfp 表达可以用于 gfp3,4的用户选择的表达式。虽然很有用, 基因介导的 GFP 表达不允许用户选择的表达在组织中的细胞子集;和病毒表达的 GFP, 虽然有利, 可侵入。随着 GFP 衍生物的出现和像 Brainbow 这样的巧妙的技术, 在组织中表达出不同的荧光蛋白更稀少, 它已经成为可能的可视化单个细胞和它们之间的相互作用在复杂的组织2,5. 但是, 这些方法以随机方式标记单元格。如果所需的实验需要对实验者定义的单个细胞或细胞的数量进行可视化, 那么它们是有限的。通过这样的实验 , 有一个基因表达的荧光蛋白 , 可以纵 , 以区别 , 在一个单一的细胞的方式 , 它从其他荧光和非荧光细胞 , 这将是有利的。

为了实现这一目标, 并可视化一个复杂的活体组织内单细胞生物学, 科学界使用的单一细胞 photoconversion 的独特的荧光蛋白6,7,8。使用 photoconvertible 蛋白的基因控制表达 (即, eos, 枫等), 当暴露于紫外线 (488 nm) 光时, 从绿色到红色荧光状态过渡, 我们可以区分单个细胞与它的荧光标记邻居6,7,8。这种方法利用连接到我们共焦显微镜的仪器, 它可以将激光栈中的光定向到感兴趣的衍射有限区域。使用此技术, 我们可以用用户定义的方式 (9、10、11) 来标记单个单元格或更大的填充。这项技术是微创与单细胞注射的病毒 GFP。作为概念的证明, 我们表明, 我们可以 photoconvert 在神经节内的单个细胞在周围神经系统和 photoconvert 更大的人群, 如位于脊髓腹侧的细胞9,10, 11,12。然后, 我们可以想象这些 photoconverted 细胞群24小时后, 以了解他们的运动和分化过程中的发展。

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研究方案

所有动物研究都是由圣母大学机构动物保育和使用委员会批准的。

1. 斑马鱼标本的制备

  1. 将一个成年男性和一个成年女性 Tg (可转换蛋白) 放入每个标准过程的交配室13。在这篇手稿中, 使用 Tg (sox10: eos) 鱼9由于访问, 但其他转基因线与 photoconvertible 蛋白可以同样使用。设置一个以上的房间, 以防鱼不下蛋。允许鱼一夜之间留在房间里。
  2. 第二天早上, 在100毫米培养皿中收集鸡蛋。在筛查前允许卵成熟到24小时后受精 (hpf)。
  3. 如果上面的动物是杂合子的转基因, 屏幕 24 hpf 菜肴为 Tg (sox10: eos) + 胚胎与 488 nm 光源和 GFP 过滤器集在解剖显微镜。分离 Tg (sox10: eos) + 胚胎, 并允许成熟到 48 hpf。
  4. 用针或镊子手动 Dechorionate 胚胎。
  5. 准备和微波5毫升的0.8% 低熔点琼脂糖溶液。
    1. 一旦琼脂糖是凉爽的触摸, 地方3-4 麻醉 Tg (sox10: eos) + 48 hpf 鱼的中心10毫米玻璃盖玻片底部培养皿。
    2. 添加足够的琼脂糖, 以覆盖盖玻片的表面, 大约1毫升。用探针针在它们的两侧排列鱼。允许琼脂糖固化以确保动物的安装。可能需要不断重新安排斑马鱼, 直到琼脂固化14。凝固需要大约2分钟。
  6. 琼脂糖凝固2分钟后, 慢慢加入含有0.02% 苯甲酸酸酯 (Tricaine) 的胚培养基, 直到琼脂和盘子的底面被淹没。这应该是大约3mL。

2. 显微镜安装和预转换成像

  1. 打开共焦软件并选择捕获和焦点窗口 [图 1]。在 "捕获" 窗口下, 选择 "捕获设置" 下拉选项卡下的实验室特定的转换成像设置 [图 1]。在这里, 实验室特定的设置称为 "鱼映像"。
  2. 将标本放在共聚焦范围内, 使用过程和微调旋钮将试样聚焦。
  3. 打开焦点窗口, 找到所需的感兴趣区域 (即背根神经节)。
  4. 在 "过滤器集" 菜单下选择 c488 激光器。将曝光率设置为300毫秒, 激光功率为 5, 并增强为 75 [图 2]。
  5. 选中捕获类型部分下的3D 框。在3D 捕获部分中, 选择使用当前位置并在当前周围检查范围。在同一节中, 将范围设置为 35, 将平面数设为 36, 并将步长调整为1。范围可以增加或减少, 以适应成像区域的深度。对于脊髓, 35-40 栈之间的范围值通常是足够的 [图 5]。
  6. 选择当前位置 [图 5]。
  7. 单击 "捕获" 窗口底部的 "开始" 以获取图像。

3. 单细胞 Photoconversion

  1. 打开共焦软件并选择捕获和焦点窗口 [图 1]。在 "捕获" 窗口下, 选择 "捕获设置" 下拉选项卡下的实验室特定的转换成像设置 [图 1]。在这里, 实验室特定的设置称为 "鱼消融全芯片。
  2. 在 "过滤器集" 菜单下选择 c488 和 c541 激光器。如果不使用相同的显微镜软件, 找到菜单选择不同的激光器, 并选择 488 nm 和 541 nm 激光器。将曝光设置为300毫秒, 激光功率为 5, 并增强为 75 [图 2]。这些激光设置是根据产生足够的荧光信号而不引起漂白或毒性而选择的。如果毒性或漂白可视化, 减少激光功率或曝光。
  3. 打开焦点窗口, 然后单击 "焦点" 窗口中的 "photomanipulation" 选项卡。相应地调整激光参数。将激光堆栈电源更改为 2, 然后单击转到。将光栅块大小更改为 1, 然后单击设置。请将双击大小更改为4。将激光线更改为 v405 [图 3]。
  4. 在 "捕获" 窗口中打开高级捕获设置。选择 "photomanipulation" 选项卡, 然后将双击重复次数更改为2。单击 "确定" (图 4)。
  5. 在焦点窗口中选择 XY 选项卡。双击 photomanipulation 选项卡中的步骤2中的激光参数 [图 3,图 4]。设置激光设置, 以 photoconvert 细胞的兴趣, 没有 photoconversion 的周围细胞。
    1. 如果相邻细胞 photoconversion 存在, 则减少激光功率。如果 photoconversion 细胞不发生, 激光功率可以增加。优选地, 设置激光功率 photoconvert 仅感兴趣的区域和不附近区域。
  6. 选中捕获类型下的 timelapse 框。然后, 单击开始[图 6A]。
  7. 打开 "实时 timelapse" 窗口后, 选择顶部工具栏上的 "圆圈" 工具 [图 7]
  8. 在单元格的靠近中心区域中绘制一个圆。右键单击绘制的圆圈, 选择酶区域, 然后等待3秒。选定区域应变暗 [图 8]。单击停止捕获。
  9. 如果成像多个动物, 请返回焦点菜单中的 XY 选项卡, 然后选择 "位置 2"。然后, 重复步骤 4.1-4.6。
  10. 要转换单元格的数量, 请按照步骤 4.1-4.4 中的协议和激光参数进行操作, 但不要绘制一个圆来酶感兴趣的区域, 请使用 "线条" 工具。在感兴趣的区域上绘制一条线, 并使用上面列出的相同参数酶区域。

4. photoconversion 后成像

  1. 一旦所有的点都 photoconverted。选择 precoversion 映像步骤3中描述的实验室特定的标准图像堆栈设置。这是在捕获窗口的 "捕获设置" 下拉选项卡下找到的 [图 5]。
  2. 选择 c488 激光器并将曝光设置为 300ms, 激光功率为 5, 并加强到 75 [图 2]。
  3. 选择与 c488 激光器在同一菜单下发现的 c541 激光器。将曝光率设置为500毫秒, 激光功率为 10, 并增强为 75 [图 9]。
  4. 选中捕获类型部分下的3D 框。在3D 捕获部分中, 选择使用当前位置并检查当前范围。在同一节中, 将范围设置为 35, 将平面数设为 36, 并将步长调整为1。范围数可能会增加或减小以适应所需的图像深度 [图 5]。
  5. 如果 "XY 焦点" 选项卡中有多个点, 请在 "捕获" 窗口中选择 "多位列表" 选项。如果没有, 请选择 "当前位置"。
  6. 单击 "捕获" 窗口底部的 "开始" 以获取图像。

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结果

Photoconversion 荧光蛋白可用于标记组织中的不同细胞6。为了证明这一点, Tg (sox10: eos)鱼9被用来表达 photoconvertible 蛋白 eos 下的调节序列sox10。Tg (sox10: eos)动物在 48 hpf 第一次安装, 然后成像, 以检测任何可能发生的非特定 photoconversion。然后, 将 eos 未转换的荧光信号与小 Eos photoconverted 荧光信号进行可视化 (

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讨论

在复杂组织中, 不同的细胞类型组织成特定的领域。最近的技术已经被用来标记这些大型组织结构中的单个细胞1,2,3。在这里, 我们演示了两种技术, 同样可以用来可视化的单细胞相互作用和细胞群的相互作用, 在复杂的组织。photoconversion 技术的优势在于, 科学家必须对细胞进行清晰的标记。借助显微镜, 它能够在较大的成像窗口...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢伯纳德 Kulemaka 和史密斯实验室的成员为他们提供有用的评论和试剂指导, Sam 康奈尔和布伦特. 雷德福3i 的成像问题和黛博拉砰, 凯伦注意和凯斯图尔特为斑马鱼护理。这项工作得到了圣母大学、伊丽莎白和迈克尔？加拉格尔家族的支持, 在巴黎圣母院, 圣母大学斑马鱼研究中心, 圣母大学的干细胞和再生医学中心。圣母.所有动物研究都是按照圣母大学 IACUC 博士的要求进行的。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tg(sox10:eos) zebrafish animalsFish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dishVWR25384-302
Embryo mediumEmbryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarosedot scientific inc9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dishTed Pella Inc.14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)Fluka analyticalA5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filtersZeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion405 nm laser
Slidebook software3i
Methylene blueKordon

参考文献

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

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